第二十三章DNA操作的基本技术.pptVIP

* ChIP-on-chip工作原理 甲醛处理使细胞内蛋白质和DNA交联 超声波打碎 特异性抗体免疫沉淀 目的DNA片段纯化、扩增 荧光标记和芯片检测 芯片数据分析 * （二）采用两步模型法进行ChIP-on-chip数据分析 两步模型法（two-step paradigm），可以从利用ChIP-on-chip获得的大量复杂数据中，经过聚类、挖掘、分析，得到有效的数据及信息，特别是可以获得大量的转录因子在基因组上结合位点的信息。 第一步在获得的数据中抽取转录因子结合位点处500~1 000 bp左右的序列信息，然后在这些序列中进行模式比对，寻找可能的模体（motif），获得粗略的目的数据集。 第二步对其进行数据挖掘和分析。 * （三）ChIP-on-chip适于DNA-核蛋白相互作用及表观遗传学研究 主要集中在两个领域： 第一，确定转录因子及其作用位点：能够将直接与蛋白结合的基因作为靶点，数据可以直接用于生物信息学分析，更直接地识别转录因子结合元件。 第二，确定基因表观遗传修饰，应用于表观遗传学研究。 表观遗传学的主要研究内容包括甲基化，组蛋白修饰和染色质重塑等。 ChIP-on-chip技术可提供基因编码区中组蛋白甲基化分布模式的信息：CpG岛表达序列标签芯片，可以显示基因组内CpG甲基化和组蛋白修饰之间的联系 * 三、芯片技术的发展——蛋白质芯片和组织芯片 蛋白质芯片技术是研究蛋白质组学的有力工具 蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片 组织芯片是以形态学为基础进行高通量检测基因表达信息的芯片技术 多组织片 组织阵列 组织微阵列 * 第五节 酵母及哺乳动物细胞杂交系统 Yeast and Mammalian Hybrid Systems * 一、酵母双杂交探测蛋白-蛋白的相互作用 酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）由S. Fields 和O. Song 于1989年提出并初步建立 * 酵母双杂交技术的基本原理 * （一）酵母双杂交系统利用报告基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用 （二）酵母双杂交可通过蛋白质相互作用鉴定/分离新的相互作用蛋白及其编码基因 （三）哺乳动物双杂交系统是在酵母双杂交系统基础上发展的 * 二、酵母单杂交系统需要构建“报告”细胞 酵母单杂交技术（yeast one-hybrid）由J. Li于1993年从酵母双杂交技术发展而来 是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法； 通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。 * 酵母单杂交技术的基本原理 * 三、蛋白质-RNA相互作用也可采用酵母三杂交系统进行分析 酵母三杂交系统（yeast three-hybrid system）于1996年由D.J.SenGupta等首先报道 （一）用于蛋白质-RNA相互作用分析的酵母三杂交系统需要杂合RNA * 酵母三杂交基本原理 * （二）酵母三杂交系统应用范围广泛 可进行与特定蛋白结合的未知RNA的筛选； 确定RNA-蛋白质相互作用的结构域； 鉴定、分离能够识别具有重要生理功能RNA的RNA结合蛋白。 * 7版教材图21-3，485页 * 7版教材图21-11，493页 * 7版教材第21章课件 * 7版教材图21-4，486页 * 7版教材图21-5，487页 CY5蓝色、Texas Red黑色、CY3红色、6-FAM绿色 * 7版教材图21-7，489页 * 7版教材图21-9，492页 目 录 目 录 目 录 * 第二十三章 DNA操作的基本技术 The Basic Technologies for DNA Manipulations * 第一节 核酸印迹技术与分子杂交 Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization * 什么是核酸分子杂交 核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization） 以DNA的变性、复性为理论基础 指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程 * 一、Southern 印迹可用于分析基因拷贝数的变化 由E. M. Southern在1975年提出 可用于分析基因拷贝数的变化 基本操作过程包括 待测DNA样品的制备和基因探针的标记； 待测DNA样品的电泳分离； 电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物； 特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。 * Southern印迹分析基本流程 滤纸 NC膜 凝胶 滤纸 电泳 转移