细胞培养实验.ppt

真菌感染 支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状 荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体 Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体 扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3．贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。 常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 细胞传代方法 细胞计数 计数结果以每毫升细胞数表示 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数 细胞计数步骤 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。　 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。 　　细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×104 注意：压线细胞只计左侧和上方的。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 冻存原则：慢冻快融 慢冻程序 4 ℃ 10 分钟 －20 ℃ 30 分钟 －80 ℃ 16 - 18 小时(或隔夜) 液氮罐长期储存。 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂。 也有用甘油的 冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO（或10％甘油） DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。 细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？ 冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml 为宜。 谢谢！ * * * * 平衡盐溶液 主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液： 生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液） pH调节液 (1) 碳酸氢钠液 (2) Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂 通常使用浓度为10～15mM 消化液 胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。 (2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶 (3)胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。 抗生素溶液 通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位 培养基 分天然培养基和合成培养基 天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液） 合成培养基 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物 目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、MEM 另有无血清培养基、无蛋白培养基 牛血清 胎牛血清应取自剖腹产的胎牛 新牛血清取自出生24小时之内的新生牛 小牛血清取自出生10－30天的小牛 使用浓度： 一般为5－20％，最常用是10％ 无机盐 CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。 氨基酸 缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型) 细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成 谷氨酰胺具有特殊的作用，补加一定量的谷氨酰胺 。 L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性 。 真核细胞培养、冻存、计数实验 （下） 指导老师：巩丽云 杨一 生物化学和分子生物学教