植物新基因克隆策略与方法.ppt

植物新基因克隆的策略与方法;小麦 水稻;马铃薯3GT cDNA的核苷酸序列与对应的氨基酸序列;基因mRNA结构 ;为何进行基因克隆? - 研究特定性状的遗传； - 用于改良植物的遗传特性。; 如何从植物中获得（取出）新基因? 有两个策略: 基于基因组DNA的克隆； 基于cDNA(基因差异表达)的克隆。 ;基于基因组DNA的克隆 即是以DNA为模板或对象的克隆。 图位克隆 T-DNA标签法 转座子标签法 ;图位克隆 图位克隆 (mapbased cloning), 是由英国剑桥大学Coulson等人于1986年首次提出。 ;原理 是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库（包括BAC、YAC 、 TAC 、PAC等），构建目的基因区域的物理图谱，再利用此图谱通过染色体步移（ chromosome walking ）逐步逼近目的基因，最终克隆目的基因，并通过遗传转化试验证实目的基因的功能。;技术流程 ;技术特点 优点: - 应用范围广，可以克隆所有类型的基因； - 不受基因大小限制，可以克隆大片段基因； - 克隆的基因是基因全长，包含编码序列和非编码序列。 局限： - 需要遗传群体； - 工作量大，时间长。;应用 图位克隆法已经被广泛地应用在植物新基因的克隆中。已分别克隆到拟南芥菜、番茄、水稻等植物中的有关抗病基因，如： - 番茄pto基因 (Martin等,1993)； - 水稻Xa21基因(Wenyuan等,1995)。;T-DNA标签法 T-DNA(Transfer DNA)是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) Ti (tumor inducing)质粒上的一段DNA，它可以从农杆菌中被转移并稳定整合到植物核基因组中。 ;原理 T-DNA标签法以人工构建好的T-DNA作为标签，通过农杆菌转化植物，构建突变体库，在对突变体鉴定的基础上，根据插入片段设计引物扩增突变体中插入点侧翼的植物基因组序列，最终实现快速鉴定和基因克隆。;技术流程 1）遗传转化，获得T-DNA插入突变体； 2）通过分子和遗传方法鉴定突变体； 3）提取DNA,酶切,环化,反向PCR扩增突变基因； 4）经序列分析后,从野生型对照中克隆突变基因。;技术特点 优点： - 方法简单； - 易获得大量突变体。 不足： - 由于T-DNA插入是随机事件，会出现多点插入或在一点多片段插入，导致后期筛选的复杂性。;转座子标签法 转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段; 在转座过程中原来位置的DNA片段(转座子)并未消失,发生转移的只是转座子的拷贝; 基因发生转座可引起插入突变使插入位置的基因失活并诱导产生突变型或在插入位置上出现新的编码基因。 ; 在植物上,目前使用的转座子有: 玉米的Ac/Ds和En/Spm, 金鱼草的Tam3; 这些转座子不仅能够同源转座,而且还能异源转座; 转座子可以转到DNA分子的任意位置,但不是随机的。;原理 ;技术流程;技术特点 转座子标签法具有与T-DNA标签法类似的优点。 但该法的效果受到转座子自身的位置效应和计量效应的影响。;应用 目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植物中克隆出抗性基因，如： -玉米的HMI特异真菌抗性基因。 ;基于cDNA(基因差异表达)的克隆 以cDNA(mRNA)为模板的基因克隆。 功能克隆法 DDRT-PCR技术 cDNA-AFLP技术 SSH技术 RAP-PCR技术 高通量测序技术 电子克隆;功能克隆法 这是一个建立在差异蛋白组分析基础上的基因克隆方法。 ;;原理 在对获得的克隆蛋白测序的基础上, 据此合成寡核苷酸探针,从cDNA 文库或基因组文库中筛选编码基因; 或者,将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA文库中筛选相应克隆。再通过测序获得基因的全长序列。 ;技术流程 蛋白质双向电泳获得蛋白表达图谱； 比较处理与对照蛋白图谱的差异，找出差异蛋白点； 回收差异蛋白，纯化，测序； 根据蛋白序列，预测其编码基因序列，通过点杂交，从cDNA文库中获得目标克隆； 通过测序获得全长基因序列。 ;应用 功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的