生物化学蛋白质分离纯化和鉴定.pptVIP

离子交换层析的原理 离子交换层析原理 离子交换层析原理 离子交换层析的洗脱 离子交换层析的洗脱过程示意 盐浓度对离子交换的影响 在离子交换层析中，盐的存在可以降低离子交换剂的离子基团与蛋白质的相反电荷基团之间的静电吸引。 盐浓度的微小变化就会直接影响离子交换纤维素对蛋白质的吸附容量。 蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先由层析柱中洗脱出来。 层析洗脱： 可以采用保持洗脱剂成分一直不变的方式洗脱 也可以采用改变洗脱剂的盐浓度或pH的方式洗脱，此方式又可以分为两种： 一、分段洗脱， 二、梯度洗脱。 梯度洗脱分离效果好，分辨率高 为使样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来，必须控制洗脱剂体积和洗脱剂的盐浓度和pH。 （四）蛋白质的选择性吸附分离 蛋白质提纯中使用最广和最有效的吸附剂是结晶磷酸钙[Ca10(P04)6(OH)2]，即羟基磷灰石。 蛋白质分子中带负电荷的基团与经磷灰石晶体的钙离子结合 蛋白质可用磷酸缓冲液从羟基磷灰石柱上洗脱下来。 羟基磷灰石也用来分离核酸和纯化病毒。 活性炭、硅胶、氧化铝和磷酸钙凝胶也常用于吸附层析。 （五）根据对配基的生物学特异性的分离方法 亲和层析是基于蛋白质与配基分子能特异性而非共价结合。 配基：能被生物大分子所识别并与之结合的原子、原子团和分子。如酶和作用底物、激素和受体蛋白、抗原与抗体互为配基。 亲和层析的原理：把待提纯的某一蛋白质的特异配基连接到载体表面上。当含有待提纯的蛋白质的混合样品加到这种层析柱上时，待提纯的蛋白质与其特异的配体结合因而吸附在配体的载体颗粒的表面上，而其它的蛋白质将通过柱子而流出。被特异性结合在柱子上的蛋白质可用自由配体分子溶液洗脱下来 测定蛋白质总量常用的方法 化学：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin酚试剂法和紫外吸收法 生物法：酶活性、激素活性、抗原抗体反应 蛋白质纯度鉴定： 　电泳、沉降、扩散、恒溶度法 　恒溶度法：在严格规定的条件下，以加入的固体蛋白质对溶解的蛋白质作图。如果蛋白质是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点，在折点以前，直线的斜率为１，在折点以后斜率为零。不纯的蛋白质的溶解度曲线常常呈现两个或两个以上的折点 六、蛋白质含量的测定与纯度鉴定 * 如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分中，可以采用差速离心方法将它分开。 如果蛋白质和细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。 前处理 粗分级： 一般采用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离 这些方法的特点是简便、处理量大，可以除去杂质又能浓缩蛋白质溶液。 细分级： 凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等 电泳法，包括区带电泳、等电聚焦作为最后的提纯步骤 必要时结晶提纯 粗分级和细分级 五、蛋白质混合物的分离方法 根据蛋白质在溶液中的下列性质分离蛋白质混合物： （1）分子的大小 （2）溶解度 （3）电荷 （4）吸附性质 （5）对其它分子的生物学亲和力 （一）根据分子大小不同的分离方法 1.透析和超过滤 利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质分离。 半透膜：玻璃纸、赛璐玢纸、火棉纸或其它材料 透析时将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里放在蒸馏水或缓冲液中，透析液可更换，直到透析袋内无机盐浓度降到最低为止 超过滤是利用压力或离心力强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质截流在膜上 2.密度梯度（区带）离心 蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度和其他合成材料的密度梯度。 60％蔗糖溶液密度可达1．28克／厘米 聚蔗糖的商品名是Ficoll,是由蔗糖和1-氯-2，3-环氧丙烷合成的高聚物，分子量约400000。 密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大，向上逐渐减小 使用密度梯度可以消除因对流和机械振动引起的区带界面的扰乱。 3.凝胶过滤 凝胶过滤的介质 凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，多孔网状结构。 凝胶的交联度或孔度决定了凝胶分离开来的蛋白质混合物的分子量范围。 经常使用的凝胶有交联葡聚糖，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。 3.凝胶过滤 凝胶过滤的原理 Vt为凝胶柱床的总体积，常称柱床体积。 Ve为某一溶质组分的洗脱体积。 Vo为孔隙体积或称外体积、外水体积 Vi为内体积或称内水体积 Vm为凝胶基质体积 凝胶床内： Vt=Vo+Vi+Vm 凝胶珠的总体积：Vt-Vo=Vi+Vm 凝胶过滤可以看成是一种液-液分配层析。凝胶珠内的水相是固定相(Vi)，