DB32/T 3680-2019玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法.pdf

ICS 65.020.20 B 16 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3680—2019 玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法 The detection of pathogen for Maize Rough Dwarf disease by dot immuobinding assay method 2019 - 12 - 04 发布 2019 - 12 - 25 实施 江苏省市场监督管理局 发 布 DB32/T 3680—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：周彤、杜琳琳、周益军、孙枫、兰莹、李硕、范永坚。 I DB32/T 3680—2019 玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法 1 范围 本标准规定了大麦、小麦、玉米植株和灰飞虱携带玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法。 本标准适用于大麦、小麦、玉米植株和灰飞虱携带玉米粗缩病病原的检测。 2 斑点酶联免疫吸附检测原理 硝酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。将抗原吸 附于硝酸纤维素膜后，可利用膜作为固相载体进行抗原抗体反应。当加入抗原的特异性抗体后，即可与 膜上的抗原结合，然后再加入带有标记物的二抗，使酶标记通过二抗和相应抗体的结合间接地交联于纤 维素膜上。最后加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色。 3 仪器设备与试剂材料 3.1 仪器设备 台式离心机（5 000 r/min ）；具盖塑料离心管：200 µL ；培养皿（直径为90 mm ）；塑料盒（规格 为100 mm×50 mm）。 3.2 试剂材料 3.2.1 试验用水均为蒸馏水，使用的化学试剂未作说明均为分析纯级别。 3.2.2 包被缓冲液：0.05 mol/L，pH值9.6 。称取 1.59 g Na CO 和2.93 g NaHCO ，加水定容至1 000 mL， 2 3 3 用HCl调pH值至9.6，4 ℃保存。 3.2.3 磷酸盐Tween 20缓冲液（0.01M PBST ）：0.01mol/L，pH=7.5 。称取40 g NaCl, 1 g KCl, 1 g KH PO 2 4 和15 g Na HPO ，加水定容至5 000 mL，用HCl调节pH值至7.5，再加入2.5 mLTween 20 ，4 ℃保存。 2 4 3.2.4 磷酸盐缓冲液（0.02M PBS ）：0.02 mol/L，pH值7.5 。称取40 g NaCl ，1 g KCl，1 g KH2PO4， 15 g Na HPO ，加水定容至2 500 mL，4 ℃保存。 2 4 3.2.5 1%脱脂奶粉封闭液：1 g脱脂奶粉加入100 mL磷酸盐Tween20缓冲液中，4 ℃保存。 3.2.6 辣根过氧化物