基因工程操作中的载体.pptxVIP

载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力为外源基因的扩增或表达提供必要条件 基因工程对载体 的要求：复制起点，在特定宿主细胞内能复制。 self replicate 选择性标记，便于筛选和鉴定。 marker genes (antibiotic Resistance ) for easy identification of cells containing the vector多克隆位点（ multiple cloning sites ， MCS），外源DNA插入其中不影响载体的复制。启动子promoter（表达载体必需）前三个条件必不可少。容纳较大的外源DNA 能力 reasonable size and circular分子量小，拷贝数多；容易从宿主细胞中分 离纯化。与特定细胞有相容性，即可转移性从安全角度考虑，要求载体不能自发转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制。分类质粒（plasmid） 噬菌体 phage?噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid： ? ＋质粒） 噬菌粒(phagemid：M13＋质粒)动物病毒（virus）用途：克隆载体 表达载体 整合载体 （ori）（ori＋Promotor） 复制类型：低拷贝（几个），高拷贝（几十几百） 失控型（条件决定拷贝） 选择标记：正选择和负选择/插入失活Ampr，Cmlr，Kanr，Tetr/ Amps，Cmls，Kans，Tets 表达细胞：原核载体、真核载体、穿梭载体shuttle（3）失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。如pBEU1、pBEU2。温度低（低于37 oC），拷贝数很少； 温度增加（40 oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。插入失活型质粒载体克隆位点位于某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329抗生素抗性失去抗生素抗性外源基因正选择的质粒载体直接选只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。这种质粒载体具有直接选择记号并可 赋予寄主细胞相应的表型。表达型载体（expression vector） 1)?特点: a. 基因的启动子序列和终止子序列； b.克隆位点是确定的（即位于启动子序列后） 2) 类型: Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子 Ⅱ型: 转录起始区终止子 + 翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+ 终止子 Ⅲ型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 + 终止子（常称之为表达分泌型载体） 多克隆位点polylinker复制起始点oriAmp选择标记基因载体普通型载体pBR322的结构图pUC18和pUC19载体三种表达型载体结构图标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr，Strr 2）生化标记基因 表达产物可催化某些易检测的生化反应， 如lacZ常用标记基因及机制1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr ，Tetracycline ） 四环素结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位。抗性基因编码一种蛋白质，与细菌细胞膜结合后阻止四环素进入细菌细胞。 2) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr） 青霉素抑制细胞壁肽聚糖合成。Apr基因编码一种酶，可特异地切割氨苄青霉素的β—内酰胺环，使氨苄青霉素失活。3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr） Chlorophenicol结合核糖体50S亚基，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺葡萄糖苷类抗生素，结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 或lacZα） β—半乳糖苷酶是α链和β链的四聚体。当lacZα在质粒上，β链在宿主菌（缺失突变体），α-互补作用才有酶活性。 诱导剂IPTG作用下， lacZα表达，二者互补产生有活性的β—半乳糖苷酶，将底物/指示剂X-gal半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝，菌落呈现兰色。 外源基因插入质粒lacZα后，不能产生α-肽， α-互补作用消失，失去β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 X-Gal（5－溴－4－氯－3－吲哚－ β 半乳糖苷） 多克隆位点lacZα IPTG：乳糖类似物，不能被降解却可以诱导 lacZα表达。 P LacZα LacZβ 转录 翻译 α