基因工程第二章基因工程工具酶.pptVIP

Taq DNA 聚合酶 Taq DNA聚合酶是一种耐热的依赖于DNA的DAN聚合酶，最初从极度嗜热的水生菌中纯化而来。 它具有2种活性，需Mg2+作辅助因子。 ５’→３’ DNA聚合酶活性； ５’→３’外切核酸酶活性。 主要应用于PCR反应。 逆转录酶 禽源逆转录酶和鼠源逆转录酶 生物活性 ５→３ＤＮＡ聚合酶活性 ＲＮＡ酶Ｈ活性 用途 类型 性质 禽源逆转录酶 鼠源逆转录酶 来 源 来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV) 从一株能表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)反转酶基因的大肠杆菌中发离得到的 肽链 两条多肽链 单链多肽 生物 活性 无３→５外切核酸酶活性、聚合酶活性、强的ＲＮＡ酶Ｈ活性 无３→５外切核酸酶活性、聚合酶活性、弱的ＲＮＡ酶Ｈ活性 pＨ值 ８．３ ７．６ ５→３ＤＮＡ聚合酶活性 　5T T T T TOH3 3AAAAAUCUGUCCUA5 　　　 ↓ ↓Mg＋＋ ↓dNTPs ↓逆转录酶 5 T T T T TAGACAGGAT 3 ? 3AAAAAUCUGUCCUA 5 ＲＮＡ酶Ｈ活性 RNA----5UCCGUA3　　　　　　 DNA----3AGGCAT5　　　　　　　　　　　　 　　　　　 ↓逆转录酶 　　　　　 ↓　　　 　　　5UC3 　　　3AGGCAT5　+　5CGUA3 用　　途 逆转录酶主要用于将ｍＲＮＡ转录成双链ｃＤＮＡ 在此反应中可用３种类型的引物： 寡脱氧胸苷酸[12-18]聚体,oligo dt 特定序列的寡核苷酸 标记带５突出端的ＤＮＡ片段 可用于双脱氧链终止法测序 DNA和RNA的修饰酶 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），简称末端转移酶（terminal transferase），能够催化5′脱氧核苷三磷酸进行5′→ 3′方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3′-OH末端。　 　 当反应混合物中只有一种dNTP时，就可以形成仅由一种核苷酸组成的3′尾巴。我们特称这种尾巴为同聚物尾巴。 5‘ p OH 3‘ 3‘ HO p 5‘ TdT Mg2+ dATP 3‘ HO p 5‘ 5‘ p AAAAAAAAAAAA OH 3‘ 3‘ HO p 5‘ T4多核苷酸激酶与DNA分子5′-末端的标记 多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）是由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，T4多核苷酸激酶催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5′-OH末端。 当使用γ-32P标记的ATP作前体物时，多核苷酸激酶便可以使底物核酸分子的5′-OH末端标记上γ-32P。这种标记又叫做正向反应（forward reaction），是一种十分有效的过程，它常用来标记核酸分子的5′-末端，或是使寡核苷酸磷酸化。 碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用 一种是从大肠杆菌中纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，简称BAP）； 一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，简称CIP）。 　　它们的共同特性是能够催化核酸分子脱掉5′磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5′-P末端转换成5′-OH末端，这就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。 　　碱性磷酸酶的这种功能，对于DNA分子克隆是很有用的 　　(1)可作为5′-末端标记的DNA片段。 (2)在DNA体外重组中，为了防止线性化的载体分子发生自我连接作用，也需要从这些片段上除去5′-P基团。 Ｓ1核酸酶 概念 Ｓ1核酸酶降解单链ＤＮＡ或ＲＮＡ产生带５磷酸的单核苷酸或寡核苷酸 用途 分析ＤＮＡ：ＲＮＡ杂交体的结构 去除ＤＮＡ片段中突出的单链尾以产生平端 打开双链ｃＤＮＡ合成中产生的发夹环 左下角处有超级链接到配伍末端 终止反应的方法： 如果酶切下来的DNA片段用于克隆实验，则反应中的酶应该消除掉以保证它不会意外地消化掉那些将在以后步骤中加入的其他DNA分子。 “消灭” 酶： 70℃保存很短的一段时间； 苯酚抽提; 加入EDTA(鳌和Mg2+)或加入SDS使酶变性。 5.限制性内切酶的酶切结果鉴定 6. 内切酶对DNA分子的不完全酶解： 完全酶切消化作用。 不完全酶