dna重组克隆的单元操作.pptxVIP

2.1 用于基因克隆的载体载体的功能及特征质粒（plasmid）噬菌体考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征1.载体的功能① 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力② 为外源基因提供复制能力或整合能力③ 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2.载体应具备的条件① 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。 ② 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 ③ 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 ④ 具有合适的筛选标记。 质粒1.质粒的基本特征 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中。绝大多数的质粒是DNA型的。绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。 质粒DNA的分子量范围：1 - 100 kb。质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合复制方向RNA II3’5’5’3’RNA Iorirop（+）RopE.coli ColE1 plasmid质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合CopRepPcopcopP/Oreprepori 可扩增性根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒 1 - 5 拷贝 stringent plasmid松弛型复制控制的质粒 30 - 50 拷贝 Relaxed plasmid 质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：① 接合型质粒： 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。② 非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F拥有相似的复制子结构，彼此不相容 携带特殊的遗传标记物质抗性：抗生素、重金属离子、紫外线、X射线物质合成：细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。2.质粒的改造与构建 野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多由pSC101、ColE1和pSF2124构建。① 删除非必需区域DNA。② 灭活某些质粒的编码基因。如mob基因，负调控基因③ 加入标记基因。④ 添加MCS，删除重复酶切位点。⑤ 加上一些调控序列。3.质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 扩增基因低拷贝质粒 表达某些毒性基因测序质粒 用于测序整合质粒 外源基因的整合穿梭质粒 基因克隆表达质粒 表达外源基因探针质粒 启动子等元件的克隆筛选4.重要的大肠杆菌质粒载体 pBR322： 松弛型复制 氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell用于基因克隆 pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ’用于基因克隆和测序 pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理PlacMCSlacZ’pUC18/195-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galbab-半乳糖苷酶的a-肽段蓝色lacZ’ pGEM-3Z：PT7MCS多拷贝PSP6pGEM-3Z装有多克隆位点（MCS）2743 bpApr正选择颜色标记 lacZ’装有两个噬菌体的强启动子ori用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶。如E.coli BL21（DE3）等。5.质粒DNA的分离纯化①碱溶法 i.用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 ocDNAii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁 L-DNAiii.加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物 cccDNAiv.加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质 v.离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质vi.乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNAvii.用无DNase的RNase去除残余的RNA ② 沸水浴法 i.用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁 iii.沸水浴40秒钟iv.离心，用无菌牙签挑去沉淀物 v.乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA噬菌体 噬菌体是一类特异性的病毒，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还