罗非鱼肠蛋白酶的分离纯化及其性质 .docVIP

第34卷第3期2010年3月　　　　　　　　　　水　产　学　报JOU RNAL O F FI SH ER IES O F CH I NA 　　　　　　　　　　　　 V ol .34,N o .3　 M ar .,2010　文章编号:1000-0615(201003-0357-10 DO I:10.3724/SP .J.1231.2010.06643 收稿日期:2009210209　　　修回日期:2009212201 资助项目:农业部“九四八”项目(2006-G40;中央级公益性专项资金项目(2007ZD 05;广东省重点项目(2005B讯作者:吴燕燕,Tel:020-********,E 2m ail:w uyy1028@yahoo . 罗非鱼肠蛋白酶的分离纯化及其性质 吴燕燕 13 ,　李来好1,　郝志明2 ,　杨贤庆 (1.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州　510300;2.国家加工食品质量监督检测中心,广东广州　510330 摘要:以罗非鱼肠为原料,采用超声波辅助提取技术、电泳技术和层析技术等对罗非鱼肠道蛋白酶进行研究,结果表明:将鱼肠匀浆经超声波提取的粗酶液,用30%~70%的硫酸铵盐进行 盐析、H itrap T M Q FF 阴离子交换柱纯化及Sephadex G 2100凝胶柱分离纯化,得到罗非鱼肠蛋白酶纯品,其比活为335U /m g,得率为32.8%;SD S 2PA G E 电泳为单一蛋白酶带,分子量为28ku 。该酶最适pH 为8.0~8.5,在pH 7.0~9.0的条件下稳定;最适温度为37~42℃,热稳定 性好;该酶的K m 值和V m ax 值分别为0.605g /L 和9.407μg /m in 。金属离子A g +、Pb 2+ 对蛋白酶有完全抑制作用,N a + 、K + 对该酶无抑制作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂能完全抑制该酶活性,胃蛋白酶抑制剂和脲素对该酶有一定抑制作用,ED TA 没有明显抑制作用,D TT 能激活该酶活性,该酶为丝氨酸蛋白酶。 关键词:罗非鱼肠;蛋白酶;纯化;性质 中图分类号:TS 254.1;S 917　　　　　　　文献标识码:A 　　蛋白酶作为市场上需求量最大的三种酶之一,在食品、医药、化工等方面都有很广泛的应用 [1] 。消化道蛋白酶是最早受到广泛研究的一 类蛋白酶,几十年来,人们发现几乎所有种属的脊椎动物消化道都含有相类似的蛋白酶。有关牛、羊、猪、马、鲸等来源的消化道蛋白酶已有研究报道 [2-3] 。在鱼类消化道蛋白酶的活性研究方面, 国外先后报道了野鳗(L abeoroh ita 、粘胡子鳃 (C la rias batrachus 、叉尾鳃(W allago a ttu 等鱼类 的消化酶活性,国内学者也对淡水白鲳(P iaractus brachypo m us 、团头鲂 (M egalobram a am bly 2 cephala 、大菱鲆(Scophthat m us m axi m us 等鱼类 的淀粉酶、蛋白酶的分布和活性进行了研究[4-5] 。 近几年,罗非鱼在我国发展迅速,已经形成从繁殖、养殖到加工的良好生产体系,2008年我国罗非鱼产量已达100万t,随着罗非鱼在全球的消费呈上升趋势,罗非鱼成为我国加工出口创汇的主要品种,罗非鱼加工过程产生大量的废弃物,所以亟待对罗非鱼加工废弃物进行高值化利用 [6] 。 集约型的鱼类加工方式为罗非鱼内脏的收集与利用提供了有利条件。鱼类内脏中蛋白酶含量丰富,所含蛋白酶在较宽的温度范围内都具有活性,是良好的蛋白酶来源 [7] 。目前,对于罗非鱼内脏 中酶类资源的开发利用研究甚少。因此,研究罗非鱼肠蛋白酶分离纯化技术及其酶学特性,为下一步开发利用罗非鱼肠蛋白酶提供理论依据。 1　材料与方法 1.1　材料与仪器 原料　　罗非鱼肠,由中山食品(水产进出口集团有限公司提供,于-18℃冷冻备用。 主要试剂　　H itrap T M Q FF,Sephadex G 2 100,T ryp sin inhibito r,Pepstatin A ,PCM B 为 Am ersham 公司产品;酪蛋白,SD S,TE M ED 为S igm a 公司产品;丙稀酰胺,三(羟甲基氨基甲烷(T ris ,甘氨酸,溴酚蓝,P M SF 为M echem 公司产 品;牛血清蛋白为G enview 公司产品; SephadexT M G 2100凝胶为Am ersham B iosciences 公司;其他试剂为国产分析纯。 主要仪器设备　　UL TRA2TU RRA XμT25匀浆机(德国IKA,G EN ESYST M5紫外-可见分光光度计(美国Ther m o Spectronic,3K30高速冷冻离心机(德国S