DNA重组的技术应用工具.pptVIP

限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。 想一想限制酶所识别的序列有什么特点？ 限制酶所识别的序列的特点 中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 EcoRⅠ SmaⅠ 3、限制性核酸内切酶的作用特点 能识别特定核苷酸序列； （专一性） 3、限制性核酸内切酶的作用特点： ②从特定部位的两个核苷酸之间切开。 （切点：磷酸二酯键） T 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 A （专一性） SmaⅠ 平末端　　　平末端 4.限制酶的作用结果： 　 EcoRⅠ 黏性末端　　　　 黏性末端 4.限制酶的作用结果： 　 EcoRⅠ 黏性末端　　　　 黏性末端 重复演示 　 EcoRⅠ 黏性末端　　　　 黏性末端 大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶EcoRΙ能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 SmaⅠ 平末端　　　平末端 限制酶SmaΙ能识别GGGCCC序列，并在G和C之间切开。 平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… EcoRⅠ ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… 不同来源的DNA片段混合 将不同种来源的DNA片段连接起来 生物A基因片段 生物B基因片段 ……G　　AATTC…… ……CTTAA　　G…… ……G　　AATTC…… ……CTTAA　　G…… 酶切 （1）限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 4.作用结果： 产生黏性末端或平末端 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。 思考? （2）“分子缝合针” —— DNA连接酶 ①作用: 把切下来的DNA片段拼接成 新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸 连接起来. ②作用原理： 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， E·coli DNA连接酶　　　　　　　　或T4DNA连接酶 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 　 T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低 T4DNA连接酶 ③类型： 类型 E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复 磷酸 二酯键 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端(效率较低) 相同点 差别 （2）“分子缝合针” —— DNA连接酶 DNA连接酶 寻根问底 P6 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么? A G T A C T A A T DNA 母链 DNA聚合酶 DNA聚合酶 T T A G A T A T C C G A C G G T T T A A … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … DNA聚合酶 DNA连接酶 区别1 区别2 相同点 1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键 1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链 2)能将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板 【探规寻律】　几种酶的作用部位 限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶作用于①部位,DNA解旋酶作用于②部位。 （3）“分子运输车”  ——基因进入受体细胞的载体 ⒈载体需要的条件： 　　⑴有1~多个限制酶切点 　　⑵对受体细胞无害 　　⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达 　　⑷有某些标记基因，便于筛选 ⒉常用运载体： 　 ⑴ 质粒 　 ⑵ 动植物病毒 （3）λ噬菌体的衍生物 　⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？ 　⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？ 　⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？ 　⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？