dna合成原理及操作使用.pptVIP

DNA合成原理及操作规范 合成原理 DNA通过固相亚磷酰胺三酯法合成：溶液中的亚磷酰胺单体通过缩合反应形成3′--5′磷酸二酯键，连接到固相载体（CPG或树脂）上。并依次延伸，直到序列的最后一个5′碱基连接上后合成结束。整个合成过程仪器自动完成，每个循环分为脱保护、活化、偶合、盖帽（封闭）、氧化五个步骤。 第一步：脱保护（Deblocking）:用三氯乙酸（TCA）去除CPG所链核苷上的DMT保护基团，暴露5′羟基，供下一步缩合。 第二步：活化（Activation）：单体与催化剂四唑混合进入合成柱，四唑转移一个质子给3′亚磷酸上二异丙胺基的N原子，质子化的氨是四唑亲核进攻的离去基团，二异丙酰胺被四唑取代，形成亚磷酰胺-四唑活性中间体。 第三步：偶合（Coupling）:亚磷酰胺-四唑中间体与CPG所连接的核苷酸的5′羟基发生缩合反应，缩合脱掉四唑，形成延长一个碱基的核苷酸链。 第四步：盖帽（Capping）:少量未反应（2%）的载体上的核苷酸链的5′羟基会在后续的循环中参加反应，生成少一个碱基的核苷酸链，因此需要在反应后进行封闭。常用乙酰化反应与5′羟基缩合成酯键，一般用混合乙酸酐和N-甲基咪唑等做乙酰化试剂。 第五步：氧化（Oxidation）:偶合反应形成的三价亚磷酸酯键很不稳定，因此要用氧化剂——碘的四氢呋喃溶液将三价磷氧化成稳定的五价磷。 依此步骤