PCR技术介绍-新版.pptVIP

* * * 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 * Polymerase Chain Reaction PCR 多聚酶链式反应技术 原理 01 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成 原理 01 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~35轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 基本实验步骤 02 核酸模板 引物? 反应缓冲系统 Taq DNA聚合酶? 4种dNTP Mg2+? 包括Tris-HCl（维持PH值），KCl（利于引物的退火），Taq聚合酶保护剂 PCR的特异性（3’端和5’端；18-25bp；0.1-0.5μM；Tm值；4种碱基随机分布；自身避免反向重复序列；引物之间不存在互补序列；3’端选择保守的氨基酸序列；与非特异性序列的同源性） PCR的合成原料，四种dNTP浓度应相等 耐高温，在热变性时不会被钝化 使DNA聚合酶具有催化活性 DNA/RNA，线性，小片段模板，核酸样品应除去存在对DNA聚合酶有抑制作用的有机溶剂和金属离子 基本实验步骤 02 实验参数设置 变性的温度与时间 退火的温度与时间 延伸的温度与时间 循环数 温度取决于DNA模板及PCR产物的G+C含量，时间取决于DNA的长度（95℃） 温度取决于引物的G+C含量及引物的长度，退火时间不是关键因素，但也应该加以控制（60℃） 温度取决于DNA聚合酶的最适温度，时间和待扩增片段长度有关（72℃） PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度（30-40次） 基本实验步骤 02 PCR产物检测 琼脂糖凝胶电泳 EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光 琼脂糖凝胶板的制备(1.5%) 加样电泳（电压80V、时间2hr） 紫外 衍生PCR技术 03 PCR技术 逆转录 PCR 相对于基本PCR，在开始阶段增加步骤：RNA →cDNA合成，是单链到双链的过程。 引物 逆转录酶 RNA水解酶 Real Time qPCR 荧光嵌合法(TB Green?) 荧光探针法 实时荧光定量PCR技术 (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 基线（Baseline） 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。 光阈值（threshold） 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期 Ct (Cycle threshold)值 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 Real Time qPCR 。 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比。 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少。 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。 Real Time qPCR 熔解曲线 确认PCR反应的特异性。 Ct值无数值（undetected）阴性 Ct值≤30.0 阳性 Ct值30.0 表达量极少 Real Time qPCR 相对定量法分析结果 内参/管家基因 GAPDH、β-actin、18S rRNA、ACTB、β2M......（至少选择两个以上） R =2?ΔΔCt 核酸表达量计算 例： 处理时间 EGFR平均CT （目的） GAPDH平均CT （内参） Normalized EGFR表达ΔCt Cali