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抗肿瘤药的药效学研究 抗微核形成实验 微核试验是检测环境致癌物、化学诱变剂引起染色体损伤的一种快速、简便的方法。 原理：遗传毒物或化学诱变剂作用于间期细胞染色质或有丝分裂染色体和纺锤体时，能导致染色体断裂、断片或整条染色体从纺锤体脱落、继而在分裂末期及以后的间期细胞中形成与主核脱离的微核。 抗Ames试验 Ames试验或称鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，是一种经济、敏感和应用广泛的检测原核生物基因突变的方法。 原理：利用沙门氏菌(S.typhimurium)的遗传基因突变性质，以组氨酸要求性的变异(his-—his+)为指标，当这些菌株欠缺DNA损伤的修复功能时，对多种致突变物质具有很高的敏感性。一般通用的菌株是TA97、TA98、TA100和TAl02。 非程序DNA合成抑制实验 非程序DNA合成(UDS)是指发生在S期以外的与DNA损伤有关的一种DNA合成。 它可以通过同位素标记的特异前体(常用3H—胸腺嘧啶核苷)参入DNA而显示。UDS是目前公认的检测真核细胞基因突变或损伤修复的有效而经济的一种方法，在当前被用于研究受试物质的抗始发突变作用。 * * 抗肿瘤药的药效学研究 抗肿瘤药根据其作用原理大致可以分为以下几类： 细胞毒性药 生物反应调节剂 分化诱导剂 化学预防药 逆转肿痛耐药性药物 抗肿瘤侵袭、转移药物的实验方法 放疗及化疗增效剂 1. 细胞毒性药的药效学研究 这类药可以通过体外和体内两种方法来评价其疗效： 体外常用的方法：、噻唑蓝实验法(MTT法)、染料排斥试验、生长曲线法、集落形成法、SRB法 体内常用的方法：动物移植性肿瘤实验法 MTT法的基本原理： 四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲[月替] (formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。 操作步骤: 1．选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI l640 培养基配成5000个／ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种200μl，37℃，5％ CO2 培养24h 2. 实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基， 每组设3~5平行孔，37℃，5％CO2 培养4~5 d 3．弃去上清液，每孔加入200 μl新鲜配制的含0.2mg／ml MTT的无血清培养基．37℃继续培养4h。小心弃上清，并加入200 μl DMSO，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为570nm，参比波长为450nm测定光密度值。 结果评定: 按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率： 肿瘤细胞生长抑制率％＝(1-OD实验/OD对照) ×100％ 以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的半数杀伤浓度IC50。合成化合物或植物提取纯品的IC50＜10 μg／m1或植物粗提物的IC50＜20 μg／m1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。 染料排斥试验的基本原理： 活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。 生长曲线法的基本原理： 在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。 集落形成法的基本原理： 克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分 析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。常用的集落形成法可分为贴壁法及半固体培养法两种。 SRB法的基本原理： SRB(sulforhodamine B)是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。 SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一个缺点是OD值可随放置时间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于