基因打靶技术的研究进展.docVIP

基因打靶技术的研究进展 药物化学12级 杜峰 摘要：基因打靶是通过外源DNA与染色体DNA同源序列之间的重组来改造基因组特定位点，从而改变生物遗传特性的方法。它可以纠正染色体特定位点上的自发突变，恢复细胞正常的生理功能；也可以把理想突变引入到基因组的某一位点，使之稳定地遗传下去。本文简要介绍基因打靶的基本原理、产生、打靶载体、打靶策略、筛选策略、条件性打靶及其该技术的实际应用等研究进展。 关键词： 基因打靶 筛选策略 随着人们逐步发现、探索、认识基因，将会有更多的生物基因组测序工作完成，基因研究进入后基因组时代，一些新的思路和方法展露，运用基因打靶技术成为后基因组时代进行功能基因组学研究的重要技术。基因打靶是建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术基础之上的一种分子生物学技术，它是一种定向改变细胞或生物个体遗传信息的试验手段。利用基因转移的方法，将外源DNA 与细胞的染色体基因组DNA 之间通过同源重组，使外源DNA整合到特定位点上修饰、改造，靶向DNA从而改造生物遗传特性的技术，实现外源基因的定点整合，又被称为基因定点同源重组。基因打靶技术的实质是同源重组及基因的置换和定点突变，它的产生是遗传工程领域的又一次革命，为发育生物学、分子遗传学等研究提供平台。 1 基本原理与分类 基本原理是指通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上的某一位点。根据其发生的机制，可分为四种类型：同源重组、位点特异性重组、转座重组和异常重组。它们共有的特征是DNA双螺旋之间的遗传物质发生交换。其中，同源重组又分成三种类型，即染色体间重组、染色体内重组、基因打靶。基本条件是：在交换区具有相同或相似的序列；双链DNA分子之间互补碱基进行配对；有重组酶的参与；异源双链区Holliday中间体的形成。Capecchi等E 对E．col i的重组进行了基因分析，并发现了与同源重组有关的酶RecA和ReeBCD。RecA能与单链和双链DNA结合，而RecBCD等在离体状态下仅对双链DNA表现有亲和性。近年来有研究人员发现在哺乳类动物细胞中也存在着类似的蛋白质，它们可能存在相似的同源重组机理。 2 基因打靶的产生和发展 基因打靶技术最早是2O世纪7O年代在酵母细胞中发展起来的。对于酵母来说，大多数的外源DNA片段通过同源重组整合到基因组内，随机插人仅占小部分，多为同源位点整合，后来基因打靶技术逐渐应用于NSL动物细胞，并得到进一步的发展和改进。80年代早期，基因打靶技术开始在哺乳动物细胞中进行模式试验，以探索发生同源整合的可能性。1985年，Smithies等首次成功的运用基因打靶技术，通过带有一条表达I3一球蛋白基因的人染色体的小鼠白血病细胞，引入外援DNA 对人l3一球蛋白基因进行了修饰，证实了利用同源重组对生物体的遗传信息进行定向改造的可能性。1989年，真正通过同源重组获得的基因敲除小鼠诞生。2O世纪90年代后，基因打靶技术得到了普遍应用和长足发展。着核移植和体细胞克隆技术的发展，人们已能对体细胞进行基因打靶，有些研究利用体细胞基因打靶成功地获得了基因缺失导致的细胞表型。有研究结果表明，外源基因EGFP在转染细胞中持续稳定表达，EGFP定点整合率约为4 ，不经药物筛选大大提高了整合效率，比传统的基因打靶技术提高了4000多倍，为转基因动物研究建立了高效的定点转基因技术。人们不断努力使得基因打靶技术进一步发展。 3 基因打靶载体 打靶载体通常包含两段与打靶区域两端同源的区域，中间一段不同源且为目的序列，并带有某种药物筛选标记。应用于基因打靶的载体构建策略通常有插入型载体和置换型载体。插入型载体，是指断裂位点位于同源序列内，选择基因紧邻同源目的序列，载体DNA同源目的序列与染色体靶位点发生一次同源交换。整个载体整合到染色体 靶位点上。置换型载体，是指断裂位点位于同源序列的外侧或两侧，选择基因位于同源目的序列内部或外侧，载体DNA同源目的序列与染色体靶位点发生两次同源交换。两者的区别在于载体与靶基因组同源序列双链断裂位点的位置不同。Orban等研究发现，基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。Lakso等也认为，在小鼠ES细胞载体中采用与打靶目的细胞系相同的同源序列可获得提高5～20倍的同源重组效率。 4 基因打靶策略 4．1 完全基因剔除策略 研究某一非持家基因的功能时，通常采用此策略。即利用同源重组的原理设计置换型载体，将靶基因关键的外显子破坏或将靶基因完全缺失。采用此种策略时要考虑到基因间的代偿效应和可能的渗漏突变对表型产生的影响 4．2 大规模随机基因捕获策略 当要研究许多基因的功能时可采用此策略。设计启动子缺失的插入型载体，可随机插入到基因组中，当插入到表达基因的外显子中时，利用筛选标记基因即可得到众多的突变体细胞，进而获得突变动物