实验四进行肌营养不良症dmd基因检测.pptxVIP

Genetics of DMD OMIM# 310200;Duchenne Muscular Dystrophy, DMD ;DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，79个外显子组成，编码3685个氨基酸、分子量为427 kD的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。;抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，60％是外显子缺失突变，通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。 本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子，其中外显子45 和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。 ;;DMD基因4个外显子的引物顺序见表： 外显子 PCR产物大小 引物F 引物R 8 360 gtcctttacacactttacctgttgag ggcctcattctcatgttctaattag 19 459 ttctaccacatcccattttcttcca gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc 45 547 aaacatggaacatccttgtggggac cattcctattagatctgtcgccctac 48 506 ttgaatacattggttaaatcccaacatg cctgaataaagtcttccttaccacac ; 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增方法，由于此方法对样本要求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下Taq DNA聚合酶催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环25-35次，模板DNA可扩增100万倍左右，整个反应可在2到3小时内完成。 ;PCR操作如下： 每一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为25?l）： 双蒸水 17.8 ?l 10XBuffer 2.5 ?l MgCl2 2 ?l dNTPs 0.5 ?l Primer R+F (混合) 1.4 ?l DNA 模板 0.5 ?l Taq-DNA聚合酶 0.3 ?l 石蜡油 1滴 放置在PCR循环仪上，循环参数设置为： Step 1 (1个循环) 94?C 5分钟 Step 2 (30个循环) 94?C 30秒 56?C 30秒 72?C 30秒 Step 3 (1个循环) 72?C 7分钟 ;琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis ): ①??配制2%的琼脂糖凝胶 配制1×TBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4克的琼脂 糖粉放入后，微波炉加热熔化,冷却至60℃，加入溴乙锭(EB)，倒入电泳槽中，插入梳子，待凝固。 ②???向电泳槽中倒入1×TBE，没过胶面2mm，小心移去梳子。 ③???取PCR扩增样品15?l加入3?l的6×载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。 ④ 接通电源，一般红色为正，极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。140V，电泳2小时左右。 ⑤ 卸下凝胶，于紫外仪上观察电泳条带，并与核酸分子量标准PUC19/MspⅠ(marker)比较。 ;10?l PCR产物;;注意事项： 1、引物设计