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细胞免疫试验 实验六 单个核细胞分离及细胞免疫功能检测 　 ? T细胞介导免疫应答的特征是由TDTH(Th1)细胞介导的以单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）浸润为主的炎症反应和TC（CTL）细胞发挥的特异性细胞毒效应。 临床上反复发作的病毒感染，胞内菌感染、真菌感染、寄生虫感染，常令人想到细胞免疫缺陷，而肿瘤患者、长期使用免疫抑制剂的患者也常有细胞免疫缺陷，必须进行细胞免疫检测。 细胞免疫检测首先是单个核细胞分离，然后进行T细胞数量和功能的测定。 【实验目的】 1.了解淋巴细胞分离方法。 2.了解人类T细胞的主要表面标志SRBC—R(CD2)、CD3的检测方法及其临床意义。 3.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义。 【实验项目】 1. 葡聚糖—泛影葡胺法分离淋巴细胞 2. 流体细胞仪分离淋巴细胞（录像） 3. T细胞总数测定（E花环试验） 4. T细胞亚群测定 一、单个核细胞分离法 （一）葡聚糖—泛影葡胺法分离单个核细胞 葡聚糖—泛影葡胺分离淋巴细胞的方法是一种密度梯度离心法，采用葡聚糖—泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）混合液（比重介于1.075～1.092之间）作为分离液，加入外周血进行离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，红细胞和多核白细胞比重较大（1.092），分布于最底层，单个核细胞比重较小（1.075～1.090），分布于血浆与分离液的交界处。界限清楚，层次分明。将该层细胞吸出，即为单个核细胞（主要是淋巴细胞）。 离心前 离心后 血细胞在密度梯度分离前后的分布示意图 【材料】 1.肝素抗凝血。 2. 单个核细胞分离液：葡聚糖—泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）混合液（比重介于1.075～ 0.092之间）。 3.（200u/ml）肝素，用生理盐水配成。 4.Hank’s液。 5.其他：注射器、吸管、毛细吸管、微量移液器、微量移液器吸嘴（TIP头）、血细胞计数板、玻片、盖玻片、水平离心机、显微镜等。 【方法】 取肝素抗凝血2ml，加等量Hank’s液稀释。 用毛细吸管吸吹稀释后的血液，使其混匀后，吸取血液沿试管壁缓缓加到含有2m1单个核细胞分离液的试管中，使血液与分离液形成明显的界面（分离液:稀释血液约为1:2）。 水平离心2000r/min 20min。小心取出试管，由于细胞比重不同，离心后管内液体分成四层：第一层为血浆；第二层为单个核细胞（95%为淋巴细胞），此层很薄，似白雾状，应仔细观察；第三层为分离液；第四层为红细胞与粒细胞。 用毛细吸管小心吸出单个核细胞层（含大量淋巴细胞与少量单核细胞）置于另一试管中，加入Hank’s液3～4ml，洗涤离心1500r/min 10min ，倾弃上清。重复洗涤2次。 末次离心后，弃去上清液。加入含10%灭活小牛血清Hank’s液1 ml，混匀后进行计数。 计数方法： A加样：将淋巴细胞悬液混匀，吸取10μl加入到40μl含10%灭活小牛血清的Hank’s液中，混匀后再吸取10μl加入到血细胞计数板上。 B加盖玻片：取盖玻片轻轻覆盖于标本上，静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。具体计数方法如下： C计算血细胞计数板上四个角的四个大方格中淋巴细胞总数（如下图）， B. 加盖玻片C. 血细胞计数计算血细胞计数板上四个角的四个大方格中单个核细胞总数。（只计算上边和右边的压边细胞，左边和下边的不计算）血细胞计数板上四个角的四个大方格 B. 加盖玻片 C. 血细胞计数 计算血细胞计数板上四个角的四个大方格中单个核细胞总数。 （只计算上边和右边的压边细胞，左边和下边的不计算） 血细胞计数板上四个角的四个大方格 1个大方格中16个小方格 血细胞计数板 A. 加样 血细胞计数板图解 D按下列公式求出单个核细胞总数。 四个大方格中单个核细胞总数单个核细胞总数= 4 ×稀释倍数×细胞悬液毫升数×104 四个大方格中单个核细胞总数 单个核细胞总数= 4 6．细胞存活率检测：取10μl淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl，混匀。取10μl加入血细胞计数板，静置片刻，置显微镜高倍镜下观察。 【结果判定】 活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入细胞内，故死细胞被染成蓝色，死细胞体积较大，无光泽。正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。 计数200个细胞中的死亡细胞数并计算其存活率： 细胞存活率=活细胞数+死细胞数活细胞数