淋巴细胞转化实验.pptxVIP

;淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。 淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。 ;T细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体 ★植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可选择性刺激T细胞增殖； ★脂多糖（LPS）可刺激B细胞增殖；;分离人外周血单个核细胞（PBMC） 分离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术) 淋巴细胞转化试验 ;实验流程－－PBMC的分离;←　ＰＢＭＣ;实验流程－－淋巴细胞转化实验;形态计数法、MTT法、CCK-8法、同位素法。 （一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转化百分率。 （二）MTT法：MTT是一种噻唑盐。活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经ＤＭＳＯ溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定OD570的值。;（四）3H-TdR 掺入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准确性好。;取静脉血3ml,用PBS（吸管1）稀释1倍（滴管1） 将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（3ml）的上方（滴管1）,2000rpm,20min 将滴管（滴管2）插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，加入PBS （吸管1）至5ml,1500rpm,10min.弃上清，再洗涤细胞1次（吸管1） （滴管2）.离心之前计数细胞 弃上清,加入完全培养基（吸管2）,重悬细胞（滴管2）.将细胞浓度调整为2*106个/ml. 将细胞加入96孔板（加样枪）,100ul/孔 A组：加入不同浓度的ConA,100ul/孔.每个浓度为2复孔.留2个孔仅加入培养基，作为空白对照. B组：加入100ul ConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml.4复孔.设空白对照.;A组：置培养箱中培养66h,加入MTT溶液20ul/孔,继续培养6hr后,去掉上清,加入DMSO100ul/孔,弃分混匀,测OD570nm值. B组：置培养箱中培养66h，制备流式标本，上机检测 ;;ConA的倍比稀释;注意无菌操作 操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数 将稀释血加于分离液时，动作要轻柔 离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机“刹车”档 分离不同种属动物的PBMC要用不同的淋巴细胞分离液 细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件 ;细胞培养技术;细胞培养概述;细胞培养实验的基本要求;细胞培养条件;细胞培养基本技术;细胞的冻存、复苏与运输;细胞培养常见污染及处理方法;谢谢