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骨代谢研究室标准操作规程 Antagomir/agomir转染细胞 姓名 陈志浩 时间（2016年02月17日修订） 【原理】 Antagomir是根据microRNA成熟体序列设计，经过特殊标记与化学修饰的单链小RNA,是专门用于抑制内源性microRNA的高效阻断剂。Agomir是经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA,通过模拟内源性的miRNA来调节靶基因的生物学功能。 【实验材料】 Lipofectamin 2000: Invitrogen，cat：11668-030 Antagomir/agomir 细胞培养板 【实验步骤】（24孔板为例） 转染前一天，4-5×104细胞接种在24孔板上， 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培养基）细胞培养基。 选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清培养基加入20pmol Antagomir/agomir (或0.8μg DNA)，柔和混匀； 混匀lipofectamin试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入2μllipofectamin试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟； 将稀释好的Antagomir/agomir和RNAi-Mate试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成Antagomir /lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物。 将100μl Antagomir/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板。 细胞在CO2培养箱中37℃温育6h后，除去复合物，更换培养基。48h后进行转染后的其它检测步骤。 【注意事项】 细胞培养板规格转染量如下参考下列标准： 细胞培养用品 表面积（mm2/孔） 细胞密度 培养基（μL /孔） Lipofectamin2000(siRNA/DNA) 96孔板 50 1.5′104-5.0′104 100μL 0.25μl/0.5μl 24孔板 200 8.0′104-2.0′105 500μL 1μl /2μl 12孔板 401 1.6′105-4.0′105 1.0 mL 2μl /4μl 6孔板 962 3.0′105-8.0′105 2.0 mL 5μl /10μl 35 mm 962 3.0′105-8.0′105 2.0 mL 5μl /10μl 60 mm 2827 1.0′106-2.5′106 6.0 mL 10μl /20μl 选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。Antagomir/agomir (DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。