实用hplc方法的建立.pdfVIP

实用HPLC方法的建立 一. 前言 二. HPLC方法建立的步骤 2.1 了解样品的有关情况 2.2 明确分析目的 2.3 样品的预处理与检测 2.4 HPLC分析模式的选择 2.5 色谱条件 2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理 2.7 定性和定量方法的建立及论证 三. 色谱条件的选择 3.1 流动相的选择 3.2 检测器的选择 3.3 样品的溶解及预处理 3.4 样品的进样量 3.5 色谱柱的选择及保护与再生 3.6 泵的选择 3.7 色谱工作站 四. 分析方法建立的实例 4.1 等度分析 4.2 梯度方法的建立 4.3 色谱柱及pH的影响 五. 色谱分析中各种图谱现象的判断 5.1 基线噪音的产生和处理 5.2 基线漂移(上漂和下漂) 5.3 倒峰的产生和消除 5.4 鬼峰的产生和消除 5.5 峰前移和退后的判断 5.6 前沿峰和拖尾峰的判断 5.7 色谱双峰的判断 5.8 色谱峰变胖的判断和处理 一. 前言 HPLC作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要 的地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分析手 段。 HPLC技术的发展和科技的进步，使得HPLC广泛应用到 各个领域。 HPLC实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各 类书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要。 HPLC技能是一个综合性的技能，需日积月累，厚积薄 发，非一日之功。 出的来，跑的快，分的开 二. HPLC方法建立的步骤 1 了解样品的有关情况，明确分析目的 2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤 3 选择仪器类型，确定检测器及其参数 4 选择液相色谱分离类型，色谱柱，流动相，其他相关条件（如波长等），进行预实验，估计最佳条件 5 优化分离条件，选择最佳检测器参数、色谱柱、流动相比例等 6 检查出现的各种现象和问题(包括仪器、样品稳定性等）选择解决办法和特殊步骤 7a 回收纯化物质 7b 定量校正 7c 定性方法 8 方法论证进入常规实验室 2.1 了解样品的有关情况 首先应对样品有足够的了解，并明确分析目的（同 一样品，不同的测试要求，其方法也可能不一 致）。 样品的重要性质包括： o 所含化合物的数目； o 化学结构（官能团）； o 分子量； o pKa值； o UV光谱图； o 被测组分在样品中的浓度范围； o 样品的溶解度、沸点及其稳定性； o 可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。 1 分析大分子、小分子还是生物分子。 一般常规的HPLC分析分子量2000 以下，大分子一 般采用凝胶色谱、生物大分子采用不能变性的色谱 体系。 2 样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。 如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混 合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是 采用梯度，是否是系列反应的产物。 3 测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。 主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完 全的问题；痕量成分则要考虑检测器的类型，采用 何种提取方法和检测的灵敏度等。 4 分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合 物、两性化合物。 非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系 的溶剂，可采用反相体系。 弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动 相中添加改性剂，调节合适的pH。 离子化合物可以采用反相，调节pH；或者添加离 子对试剂；也可采用离子交换。 两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出 峰快的则考虑离子交换；也可考虑衍生后测定。 对于极性的糖类物质，可用NH2柱，有条件的用聚 合物的糖柱。多糖类的则要采用凝胶系统。 大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定 的色谱柱，多为聚合物柱子。 手性化合物，则要用手性流动性或者采用手性柱。 5 样品的溶解度、沸点 样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常 重要，测定其溶解的性能