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2020-03-04 发布于浙江
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基因敲除步骤.doc

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TSB培养基。。1.首先从平板上挑取菌体在液体培养基中培养过夜，第二天早上取200ul活化菌液至10ml新鲜培养基中，37度培养2小时待OD值为0.4~0.6；2.将你的培养试管置于冰上20min，并预冷离心机至2℃。9000rpm,2℃，30s离心，无菌工作台内，除上清；3.用在冰箱预冷的无菌去离子水（最好是里面还含有冰块的水，能保持低的温度）10ml吹打重悬菌体，9000rpm,?2℃，1min离心；4.去上清，重复步骤3；5.去上清，留取300~400ul左右重悬菌体，分装成10管，每管30~40ul，向管中加入2μL?质粒，吹打混匀，并将混合液转入冰上预冷的1mm电转杯中槽内，并将转有混合液的电转杯置冰上15min；6.用滤纸拭干电转杯外侧，1350V，电转，记录时间常数。7.每杯电转后产物，用900μL低盐培养基（低盐?LB培养基（NaCl?0.5%））分三次洗脱至无菌EP管（EP管总体积1.5ml，看你们是否有，没有的话试管应该也可以）中，每次300μL。8.复苏，37℃，1000rpm,振荡培养60～70min。9.培养：8000rpm，5min，去上清，留取100μL上清液重悬菌体，吸至含有抗生素的平板上，涂抹均匀，37℃倒置培养过夜。这个只是质粒电转用，如果你是进行同源重组，前面需要一个诱导过程，就只有第一步需要一个诱导过程