内蒙古农业大学生物化学与分子生物学实验教学中心.pptxVIP

DNA 重 组 ;实验原理 实验仪器 实验步骤 实验试剂 注意事项;实验原理; T4 噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅助因子ATP 形成酶-AMP 复合物；然后，酶-AMP 复合物再结合到具有5 ’磷酸基和3 ’羟基切口的DNA 上，使DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。 DNA 重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP 处理克服。 连接反应的温度在37 ℃ 时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12 - 16 ℃ ，连接12 - l6h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。; 重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体诸惧有一段大肠杆菌β 半乳糖苷酶的启动子及其编码。肤链的DNA 序列，此结构称为lac Z基因。lac Z基因编码的α肽链是β 半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146 个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β 半乳糖苷酶