动物病毒学-实验三 传代细胞的培养与细胞活力检测.ppt

取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。 加入1ml 胰酶轻摇细胞瓶，静置1min，洗掉漂浮的和贴壁不紧的细胞，弃去胰酶；重复一次，将细胞瓶倒置放入温箱中消化 消化5min左右，加入6ml生长液，反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，丢掉部分细胞，留下2ml细胞（1:3传） 加入生长液补足6ml，然后置37℃培养箱培养，培养2天左右即可长成单层。 操作步骤： 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，细胞培养过程中有时需要测定细胞的活力以了解细胞的生长状态。此外，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 六、细胞活力检测的原理 细胞活力分析可以测定细胞悬液中存活细胞的百分比。一般通过染料排除的染色方法实现，即具有完整细胞膜的细胞能够将染料排除在外从而不被染色，而不具备完整细胞膜的细胞则能够吸收染料而被染色。 用于排除染色法的染料通常选择台盼蓝，但是赤藓红和萘黑也常被使用。 吸收染料的染色方法也可以用于测定细胞活力。这种情况下，染料被活细胞正常吸收，而死细胞则不会。 七、细胞活力检测的步骤 吸取100 uL重悬的细胞到1.5mlEP管内，加入100 uL台盼蓝染色液，轻轻混匀，染色3分钟 取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 吸取少许染色后的细胞，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让细胞悬液利用液体的表面张力充满计数区（勿使气泡产生），并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余细胞悬液。 替代方法：吸取少量经过染色的细胞，将细胞悬液滴入一小滴在计数区上（不要使计数区两边平台沾上细胞悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。 滴入一小滴细胞悬液 滴入一小滴细胞悬液 计数时，先用低倍镜，光线要稍暗些，找到计数室的格后，把中央的大方格置于视野之中，然后转用高倍镜。 计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个区域的蓝色细胞和细胞总数。 （计数时间不要太长，否则活 细胞也会死亡并开始吸收染料） 细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数×100%? 八、思考题 传代细胞传代的注意事项 细胞活力检测的原理 细胞培养过程中常见污染物，如何避免污染 传代细胞的培养条件 实验三 传代细胞的培养与细胞活力检测（以猪肾细胞IBRS-2为例） 了解不同传代细胞的形态以及传代方法 掌握IBRS-2细胞的传代方法 掌握细胞活力测定的操作步骤、计算方法及含义 一、实验目的 细胞培养的基本概念 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3-6次。 培养细胞的特性 培养细胞的生长方式： 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。多为各种实体瘤细胞 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。多为各种造血系统肿瘤细胞 每代贴附生长细胞的生长过程： 游离期；贴壁期；潜伏期；对数生长期；停止期（平台期） 游离期：细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟-5 小时。 贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。大部分细胞株在 10分钟－5 小时内贴壁。 潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 细胞培养中的污染 1、细菌污染 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养基中加入了抗生素，也可能因为操作不慎而引起污染。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养基变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。 2、真菌污染 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，培养细胞受真菌污染后，可见培养基中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养基一般不发生混浊。 倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 3、支原体污染 4、病毒污染 5、非同种细胞污染 二、材料 吸管、吸球 IBRS-2细胞一瓶 0.25%胰酶 生长液（含10%血清） 台盼蓝（0.4%） 细胞计数板 消化液 (胰蛋白酶或者胰酶） 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞之