DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳.docxVIP

1004606526045160307015601245二、聚丙烯酰胺凝胶电泳3.55.08.012.015.020.0 100 460 65 260 45 160 30 70 15 60 12 45 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0 1。变性： 　　聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、 小于 1Kb 的 DNA 片段和 DNA 序列分 析.其装载的样品量大， 回收 DNA 纯度高.长度仅相差 0.2%(即 500bp 中的 1bp)的核 苷酸 分子即能分离. 　　聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂 TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下， 丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一 亚甲 双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而 形成凝胶. 　　聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定 的，不同浓度丙烯酰胺和 DNA 的 有效分离范围见表 2. 丙烯酰胺(%)  有效分离范围(bp)  溴酚兰*  二甲苯青* 100～2000 80～500 60～400 40～200 25～150 10～100 　　*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链 DNA 分 子所含碱基对数目(bp). 片先用自来水，再用去离子水，应拿取玻璃板的边 片 先用自来水，再用去离子水，应拿取玻璃板的边缘部分或 戴手套操作，以免手上的油脂残留再玻璃板的工作面上。 用乙醇冲洗玻璃板，并将其至于一边晾干。 在试验台上，在玻璃板的两侧将间隔片平行至于边缘放妥： 用凡士林轻涂以帮组与间隔片在后面操作中保持原位；将 那板在间隔片上放稳。 (一)材料 1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件. 2．准备工作：1。必要时可用 KOH/甲醇清洗玻璃板和间隔 2．用温热的去污剂溶液洗涤玻璃片和间隔片，再充分漂洗， 3．安装玻璃与间隔片：将较大的（不带拗口）玻璃板平放 　　2.30%丙烯酰胺 　　丙烯酰胺，29 克 　　N，N一亚甲基双丙烯酰胺，1 克 　　H2O，加至 100ml 　　装于棕色瓶内，4℃可保存二个月. 　　3.10%过硫酸铵 　　过硫酰铵，1 克 　　加水至，10ml 　　4℃可保存一周，-20℃可保存一个月. PH8.3两玻璃板间的胶床中，直到液去覆盖层，并用吸水纸吸净。 PH8.3 两玻璃板间的胶床中，直到液 去覆盖层，并用吸水纸吸净。 4.1XTBE 电泳缓冲液：（89mmol/lTris-硼酸， 2mmol/lEDTA(ph8.0),TBE 用 5×储备液稀释即可，缓冲液 　　5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)35ul (二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 根据分离 DNA 片段的大小及需凝胶的容积， 配制聚丙烯酰 胺凝胶. 　　1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底 部用 1%的琼脂 糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏 出. 　　2.将装好的玻璃电泳板倾斜成 45～60℃角. 　　3.按表 3 配制所需%浓度凝胶的毫升数. 4.将  上述液体加入 TEMED35ul 后，立即混匀，缓缓倒入 体接近溢出时为止.最后加 入 1mlH2O 覆盖层，室温静置 30min 左右至分离胶凝聚，倾 将上述液体混匀后加入电泳槽中立即插入适当的梳子， 密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在 一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使 成 10° 角，可减少液体泄漏的机会. 室温聚合 1h 后（聚合完全后，用 1×TBE 浸润的纸巾保 绕梳子和凝胶的顶部，然后用 saran wrap 膜密封整块凝胶， 缓冲液，从聚合的凝胶中，加到样品孔内，加样时不泡要用注射 缓冲液，从聚合的凝胶中 ，加到样品孔内，加样时不 泡要用注射器针头除去） 心移去一块玻 4 度保存，直至使用），将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒 入 1XTBE 缓冲液 　　7. .当准备好电泳时，在梳子周围及顶部喷些 1×TBE 小心取出梳子，立即用注射器吸取 1×TBE 缓冲液冲洗加样 孔，因为梳子取出后，梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的 丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导 致以后 DNA 电泳带型不规则.用剃刀除去凝胶底部的密封条 　　8.将 DNA 样品与适量的载样缓冲液混匀后(．制备样品： 取中号 EP 管，每管加入 10ul,4*loading buffer,加样 20－30ul（视样品浓度而定）,混匀后，煮沸 5min,离心) 要产生气泡.（加样孔中的气 　　9.接好电极，电压为 1-8V/cm，进行电泳.电泳 80V×1hr,然后调置 100V*4hr 　　10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳. 　　11.电泳毕，切断电源，弃去