MIC的测定(微量二倍稀释法).docxVIP

微量肉汤稀释法测 MIC 一、试验原理目的 细菌在 96 孔板 MH 培养基中生长，过段时间由于量大会产生白色沉淀，很 容易区别有无菌落生长，将抑菌剂依次对倍稀释，加入菌悬液培养一段时间后， 无沉淀的最后一个空即为 MIC 浓度。本试验微量样品即可测出最小抑菌浓度， 且 96 孔板占地少，一板可做 96 个试验梯度，适用于大批量的检测试验，节约 时间。 二、试验器材、化学试剂及菌种 96 孔板、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL-1000uL 微量移液器、以及 配套的枪头、10mL 离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥 箱、生化培养箱、MH 肉汤培养基、PBS 缓冲液、无菌水。 菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉 棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌 三、试验准备 1、培养基的配置 MH 培养基 42g，蒸馏水 1000ml。灭菌后待用，若一次用不完可放入 4℃ 冰箱中放置。使用前拿出放置室温即可。 2、工器具的灭菌 将配置好的 MH 培养基、PBS 缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高 压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌 25min。试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃ 杀菌 2h。96 孔板在超洁净工作台上紫外杀菌 30min 以上。 2、抑菌剂的配置 抗菌药物的溶解与稀释，一般情况下，水溶性抗菌药物采用灭菌蒸馏水溶 解，而对于不溶或者难溶于水的抗菌药物要根据其特性，采用甲醇，缓冲液， NaOH 溶液，DMSO 溶液等，尽量将抗菌药物溶解后用蒸馏水或者缓冲液稀释 后，作为抗菌药原液。 3.、菌悬液的配置 从冰箱取出需要测试的菌种活化 0.5h 后，加入 5mL 的 PBS 缓冲液将斜面 上，在手掌上轻轻振打 80 次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。吸取 8 6 8 6 6 4 1mL 的菌液加入到 4mL 的 PBS 缓冲液中，再吸取 1mL 稀释的菌悬液依次进行 5 倍梯度稀释，选择 10 CFU/mL 左右的菌悬液或 10 CFU/mL 左右的孢子悬浮液 （对比 0.5 麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓 度约为 10 CFU/mL 左右的菌悬液或 10 CFU/mL 左右的孢子悬浮液），再吸取 0.5ml 加入到 4.5mlMH 培养基中，用枪头吹匀待用。 四、试验步骤 在 96 孔板每个孔加入 MH 肉汤培养基 100μl 。 在 A/B/C 三排的第一孔加配好的药液 100 μl，然后对药物进行二倍稀释。即， 第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打（至少三次以上）使药物与肉汤充分混 匀，然后吸取 100μl 加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直 至最后一孔，第 12 列吸出 100ul 扔掉。 再在每一孔中加入稀释好的菌液 100μl,重复做三次（A/B/C 三排样品）。 在同一块板上的 G 排上做一排阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液）和在 H 排 上做一排阳性对照（加菌液不加药液）。 将 96 孔板放入 37℃恒温培养箱 16～20 小时后，观察结果。 五、结果观察记录： 若有菌生长孔板底部会有白色沉淀。 MIC 值的判定：96 孔板上横排中未有沉淀的最后一孔所对应的浓度便为该 药的 MIC 值。 观察所做的阴性对照和阳性对照结果。 记录结果并将每种药物的 MIC 值。 六、注意事项： 无菌操作 除移液枪和 96 孔板外其他所有用具都需经过高压灭菌处理。 超净台使用前后都需打开紫外灯进行消毒；不能拿酒精面球球擦挡板。 3、 操作前洗手，用酒精棉球擦手。 4、每次枪头过瓶口，瓶口都要经火焰烧过；移液枪和枪头不能在究竟灯上烤。 5、 操作过程中加液尽可能不将 96 孔板盖完全打开。