生物素－链霉亲和素标记免疫技术.ppt

* * * * * * * * * 第十三章 生物素－链霉亲和素 标记免疫技术 Biotin-Avidin Labelling  Immunoassay Tech  * 第一节 生物素和亲和素 第二节 生物素和亲和素标记物的制备 第三节 生物素和亲和素系统的技术方法 第四节 技术评价与应用领域 * 第一节 生物素和亲和素 生物素（biotin，B）,又称维生素H 、B7,动植物中广泛存在，卵黄和肝中含量高； MW244.31D,有两个环状结构； Ⅰ环为咪唑酮环，为与亲和素结合部位； Ⅱ环为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端可与生物大分子连接，形成生物素标记物。 T lymphocyte 咪唑酮环 羧基 活化生物素 噻吩环上戊酸侧链的羧基经活化修饰后形成的衍生物，只有活化生物素才能偶联各种其他生物大分子，如蛋白质、多糖、荧光素等。 * 生物素标记蛋白质的特点 生物素需活化后才能通过侧链与蛋白质分子连接； 多价性-一个蛋白质分子可以被多个生物素标记(放大效应)； 抗原、抗体标记后需保持活性不变； 多用BNHS标记抗体和中性或偏碱性的蛋 白质，BHZ标记偏酸性蛋白（抗原） 可影响标记物活性，如碱性磷酸酶标记后活性会降低； * 亲和素（avidin,A） 从蛋清中提取的一种碱性糖蛋白，耐热及多种蛋白水解酶作用，每个分子由4条相同亚基组成，每个亚基都可以结合一个生物素分子。 与生物素结合的特异性高、稳定性好。K=1015L/mol（BA），K=105～11L/mol（antigen-antibody） 但与聚苯乙烯的非特异性吸附较高。 * 亲和素活性单位 以亲和素结合生物素的量来表示； 结合1μg生物素所需要的亲合素量为1个亲合素活性单位。一般1mg亲合素约含13～15个活性单位。 * 链霉亲合素（streptavidin,SA） 与亲合素(A)有类似生物学特性的一种蛋白质。由Streptomyces avidinii菌分泌的一种蛋白质，SA分子量为65000，由4条序列相同的肽链构成，每条SA肽链可以结合1个生物素分子。 SA与A的ka虽然相同，但在实际应用中其检测灵敏度明显优于A。 * A的高pI及高含糖结构导致在聚苯乙烯板和硝酸纤维素膜上或与组织细胞DNA结合时，易产生一定程度的非特异性结合，造成较高的显色背景，而SA较A在应用中明显克服了这一缺点。 * 亲和素（A） 链霉亲合素 (SA) 结构 四亚基 四亚基 分子量 68kD 65kD pI 10 6.0 氨基酸特点 碱性氨基酸较多 酸性氨基酸较多 糖基化 多糖基化 无糖基化 结合生物素能力 4 4 亲和常数（K） 1015 1015 活性（U） 13～15 15～18 亲和素和链霉亲合素理化特性比较 * 第二节 生物素和亲和素 标记物的制备 一、生物素标记物的制备 1、作为标记物，活化生物素直接标记大分子生物活性物质如抗原、抗体； 根据抗原或抗体分子所带可标记基团的类型（氨基、醛基或巯 基）以及分子的等电点 2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成新的标记物。 3、生物素标记抗体（IgG）的制备 基本原理 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽键，从而使其标记上生物素。 * 4、实验流程 1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶液； 2、用0.1mg/L,pH9.0 NaHCO3溶液将纯化的1g抗体稀释为1～2g/L; 3、按BNHS：抗体1：8 ～1：15（体积比）混合，室温搅拌下反应2 ～4小时； 4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 ℃透析过夜； 5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻存备用。 * 二、亲和素标记物的制备 1、几乎所有用于标记的物质均可与亲和素结合，小分子如I125、胶体金、荧光素；大分子如蛋白酶、抗原/体、荧光蛋白等 直接标记法：A+E 改良过碘酸钠法、戊二醛法 间接标记法：A+B+E 2、直接标记法（HRP-A/SA） a.改良过碘酸钠法 b.戊二醛法 戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和亲和素上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 * 戊二醛分子式 3、间接标记法（A/SA-B-HRP） 首先将HRP标记上生物素 再利用亲和素与生物素间的特异结合能力，合成亲和素-生物素-HRP复合物（ABC） * 注意事项：如何除去未标记物？ 各种成份的比例？ * 第三节 生物素和亲和素 系统的技术方法 特异性高、亲和力高、稳定性好、多级放大作用；