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T 、B 淋巴细胞分离试验 2006-12-28 00:00:00 来源： 评论： 0 我要评论 淋巴细胞主要分 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫 学实验时，首先需分离出纯的 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞。本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异 硫氢化物（简称 AET ）处理的绵羊红细胞（ SRBC）混合后，其中全部 T 淋巴细胞均能吸附 AET—SRBC… PCR 实验交流 核酸实验交流 细胞实验交流 蛋白实验交流 免疫实验交流 生物软件交 流 淋巴细胞主要分 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在 进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞。本试验的原理为： 淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称 AET ）处理的绵羊红细胞（ SRBC）混合后，其 中全部 T 淋巴细胞均能吸附 AET—SRBC ，形成牢固稳定而巨大的 E— 花环，较正常未处理 的 SRBC 形成的 E— 花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细 胞分层液分离时， AET—E 花环易沉于管底，而未形成 E— 花环的 T 淋巴细胞，用低渗液解 花环周围的 AET—SRBC ，便可获得纯 T 淋巴细胞，而 B 淋巴细胞可直接取自分层液的界面。 材料及 试剂 ： a) 新鲜豚鼠血 b) 兔红细胞（ RRBC） c) 溴花二氨基异硫氢化物（ AET ） d) 淋巴细胞分层液 e) 其它 Hanks 液，含小牛血清的 199 培养液，无菌生理盐水， 3.5% 氯化钠溶液，离心机 等。 方法： 1.AET — RRBC制备 （1 ）.AET 溶液的制备 称取 AET 粉剂 402 毫克，溶于 10 毫升蒸馏水中，使成为 0.143M 溶液，用 4NNaOH 溶液 调 pH9.0 。该溶液必须新鲜配制，不宜久存。 （2 ）.AET 处理 RRBC 取洗涤好压积的 RRBC，按一份压积 AET— RRBC 加入 4 份新鲜配制的 pH9.0 的 AET 溶液 充分混匀置 37 ℃水浴 15 分钟，每隔 5 分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至 离心管 口 （1—2 厘米） 1800 转/ 分离心 5 分钟。连续洗涤 3—5 次，每洗一次，必须充分摇匀，以 减少 AET— RRBC 粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现象，则用含小牛血清的 199 培 养基再洗一次，最后配成 10%AET— RRBC 悬液，置 4 ℃保存，不得超过 5 天。 （3 ）.1%AET— RRBC 的配制： 将预先配制并保存于 4 ℃冰箱的 10% 浓度的 AET— RRBC ，以含 10% 小牛血清的 199 培养 液稀释至 1% 。 2. 从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后试验。 3.AET —E花环试验： 将分离的单个核细胞（ 2 ⅹ106/ 毫升）与等量 1%AET—RRBC 混合，置 37 ℃水浴 15 分钟， 每隔 5 分钟摇匀一次，分装数管，每管 2—3 毫升，低速离心（ 1000 转/ 分钟） 5 分钟后， 移至 4 ℃冰箱 45 分钟。 4.T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞的分离 将形成 E— 花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状的细胞，即为富 含 B 淋巴细胞群。沉淀于管底的 E—花环，用 Hanks 液洗一次