实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶.pdfVIP

. 亲和层析法纯化胰蛋白酶 一．实验目的 1. 理解亲和层析法的基本原理， 并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操 作方法； 2. 掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。 二．实验原理 亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一 定的亲和力而使生物分子得以分离。 这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离 纯化方法。许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。 这种分子之间的结合能力做亲和力。 亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一 亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术” 。 在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（ Ligand ），在不损害其生 物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如 Sepharose4B）制成亲 和吸附剂， 然后装柱。 再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子， 这时 绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留， 只有与配基 互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件， 使结合在配基上的物质解离下来。 这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯 化的形式在洗脱液中出现。 本实验为了纯化胰蛋白酶， 采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配 基制成亲和吸附剂。 鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂， 对牛和猪的胰 蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在 pH=7-8 的缓冲溶液中卵粘 蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在 pH=2-3 时，又能被解离下来。采用鸡卵粘蛋 白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋 白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到 10-20 倍以上。 三．实验方法步骤 1. 鸡卵粘蛋白的制备 取蛋清 60ml，加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮：三氯乙酸 =40:60 ） 后，出现大量白色沉淀，搅匀后室温静置 4h 以上，待清蛋白完全沉淀， 3000rpm 离心 10min，弃去沉淀， 47ml 上清液倒入 250ml 锥形瓶并用塑料薄膜封好， 置于 页脚 . 冰箱中冰浴片刻， 缓慢加入 3 倍体积 (141ml) 的预冷丙酮，搅匀后冰浴 4h 直到出 现沉淀 , 用真空泵抽去部分上清液，剩余部分的部分沉淀和上清液全部转移至离 心管中，以 3000rpm 下离心 15min，弃上清液。离心管底部沉淀物放置真空干燥 器内，抽气去丙酮，然后用 20ml 蒸馏水溶解。之后将鸡卵粘蛋白溶液装入透析 袋内对蒸馏水透析。将透析液转移到离心管内，再次以 3000rpm 下离心 15min。 2. 鸡卵粘蛋白含量测定 取上述离心液 0.5ml 稀释 6 倍，测 A280nm，求其浓度，由于浓度值过大，再次 稀释 10 倍，测 A280nm，得到最终的浓度。 3. 胰蛋白酶的比活性测定 在比色杯中加入 2.95mlBAEE底物溶液和 20 μl 的胰蛋白酶溶液，在 λ253nm 的条件下测定 4 分钟内的 A253 ，算出 ?A 的值。 4. 鸡卵粘蛋白的抑制比活性测定 以苯甲酰 -L- 精氨酸乙酯 (BAEE)为底物测定胰蛋白酶