NGS测序技术与分析流程图精品课件.ppt

ABI SOLiD荧光结合和结果示例 @SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 T11.0203.3.1113211010332111302330201 +SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 !36!8/8:!:!462>@6=(<8>8.<;2:*9748078 @SRR029969.2 VAB_5551_13_468_F3 length=35 T202312302.3333130131131322113203131 +SRR029969.2 VAB_5551_13_468_F3 length=35 !9),4/3)&$!(&(573(96,'7&91>)43),(95, A. SOLiD Oligo荧光基团模式图 B. SOLiD 测序结果示例（Color Space) SOLiD 的特点与主要应用 读长较短，50-75bp 精度高，可达Q40 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G 主要应用：基因组重测序、SNP检测等 Ion torrent Ion Torrent 测序原理 精度 Examples: ?? 90% con?dence (10% error rate) = Q10 ?? 99% con?dence (1% error rate) = Q20 ?? 99.9% con?dence (.1% error rate) = Q30 三种平台的技术差异 平台 454 Solexa SOLiD PCR 磁珠乳化PCR 桥式PCR 磁珠乳化PCR 测序载体 磁珠 玻片 玻片 测序方式 焦磷酸、荧光 可逆终止物、荧光 连接酶、荧光 结果序列 FastQ FastQ CSFastQ 三种平台的效能参数差异 平 台 读长 通量 周期 精度 Solexa HiSeq 2000 Single-end: 1 x 35 bp Paired-end: 2 x 50 bp Paired-end: 2 x 100 bp 25 Gb/d ~1.5d ~4d ~8d ?50 bp 85%以上 Q30 ?100 bp 80%以上 Q30 SOLiD 5500xl Single-end: 75 bp Paired-end: 75 x 35 bp Mate-pair: 60 x 60 bp 20 – 30 Gb/d 1d/ 1lane 7d/ 12 lane 7d/ 12 lane Q40 454 GS FLX 400 - 600 bp 400 – 600 Mb/Run 10h Q20 转录组测序测序流程 全转录组总RNA polyT富集mRNA 去除rRNA Non-coding RNA 转录组mRNA RNA片段化、纯化、检测产量 连接两端接头序列 逆转录生成cDNA 选择适当长度cDNA进行扩增 纯化扩增产物，评估产量 上机进行高通量测序 转录组主要分析内容 无参考序列 转录组分析内容 有参考序列 转录组分析内容 1 测序数据产量统计，数据成分和质量评估； 2 Contig及Scaffold长度分布 3 Unigene的长度分布和功能注释，GO分类，Pathway分析，差异表达分析 4 蛋白功能预测与分类，差异表达基因GO富集和 Pathway富集分析。 1 基本数据统计，比对参考序列 2 序列在基因组上在分布 3 测序深度分析、随机性评估和基因差异表达分析 4 新基因预测，基因可变剪接鉴定和基因融合鉴定等。 小RNA测序 http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-EstructuraDelGenoma/animaciones/secuencia.swf * 总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。 * /454_scu/item/da0d650b7f04f1cddce5b038 * /read-htm-tid-820.html /html/201104/3095379.html * 前期测序文库构建和454类似。都有序列片段化后加