一外周血淋巴细胞的分离.ppt

实验一外周血淋巴细胞的分离 PBMC: peripherial blood mononuclear cell (T cell, B cell and monocyte) 原 理 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 原 理 实验步骤 1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2） 实验步骤 3.18℃，1500r/min，离心30min 4. 轻轻吸取PBMC层移入另一试管中 5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心5min ，弃上清。 注意事项 每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 Ficoll应适量，外周血应充分稀释 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 细胞计数 1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液