神经生物学研究的常用方法.pdfVIP

1.神经生物学研究的常用方法 神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。总体上，神经生物学的研究 方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子 生物学方法及脑成像技术。 7.1 形态学方法 神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其 他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。 7.1.1 束路追踪法 追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标， 它对研究神经元的功能、 神经 系统的发育和成熟都具有重要意义。 这种方法学的建立始于 19世纪末的逆行和顺性溃变 （顺 行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃 变）研究。20世纪 40年代主要手段是镀银染色法， 根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。 20世纪 50年代发展了 Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显 示细纤维， 1971年 Kristenson等将辣根过氧化物酶（ HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在 脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现 HRP的积累 。不久 LaVail 正式使用 HRP作为 轴突逆行追踪， 以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。 HRP可被神经末梢、 胞体和树突吸 收，轴突损伤部分也可摄入。在胞体内， HRP 的活性可持续 4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈 阳性反应而显现出来。被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。 除了 HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。 7.1.2 免疫组织化学 免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜 表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速， 应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆 抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许 多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。 组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗 原注入另一种动物体内，后者即产生相应的特异性抗体（免疫球蛋白） 。从被免疫动物的血 清中提取出该抗体，再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切 片或细胞，标记抗体即与细胞的相应蛋白质（抗原）发生特异性结合。常用的荧光素是异 硫氰酸荧光素（ FITC ）和四甲基异硫氰酸罗丹明（ TRITC ），在荧光显微镜下可观察荧光抗 体抗原复合物。常用的酶是辣根过氧化物酶（ horseradish peroxidase,HRP,从辣根菜中提取 的），它的底物是 3 ，3 －二氨基、联苯胺（ DAB ）和 H2 2 O ,HRP 使 DAB 氧化形成棕黄色产 物，可在光镜和电镜下观察。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电镜 下观察。 标记抗体被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的 抗原直接结合。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一 抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称 二抗），再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗－标记 二抗复合物。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感 度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是一 种 称 之 为 过 氧 化 物 酶 － 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 （peroxidase-antiperoxidase complex method,PAS 法），该法除需一抗和二抗外，还需制备 HRP 标记的抗酶抗体，即