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最新课件 第四.一部分: 人TNF-α检测实验原理 基本实验原理: 双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人TNF-α单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的人TNF-α会与单抗结合，游离的成分被洗去。同时加入生物素化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人TNF-α抗体与结合在单抗上的人TNF-α结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有人TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A值，人TNF-α浓度与A450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人TNF-α浓度。 * 最新课件 第四.二部分: 实验试剂、材料和仪器设备 实验标本 试剂盒及其内容物 实验材料 仪器设备 * 最新课件 实验标本 人外周血(血清) 1.收集血液的试管应为无热源和内毒素试管 2.血浆抗凝剂为EDTA 3.标本应清澈透明, 如有悬浮物应离心除去 4.避免溶血, 高血脂 5.标本收集后若不及时检测,按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融 6.可根据实际情况, 将标本作适当倍数稀释(建议做预实验, 以确定稀释倍数) * 最新课件 试剂盒及其内容物 1a 标准品1支(4000pg，冻干)4℃ 1b 标准品和标本稀释液(粉红色) 1瓶(15ml)4℃ 2a 浓缩生物素化抗体2/1支*(60μl)4℃ 2b 生物素化抗体稀释液（绿色）（15ml）4 ℃ 3a 浓缩酶结合物2/1支*(60μl)4℃(避光) 3b 酶结合物稀释液(黄色)1瓶(15ml)4℃ 4 浓缩洗涤液 20×(兰色)1瓶(15ml)4℃ 5 显色剂1瓶(6ml)4℃ 6 终止液1瓶(12ml)4℃ 抗体包被板条8×12 或 8×6 4℃ 封板胶纸1张 说明书1份 *:[96/48 Test] * 最新课件 实验材料与设备 1.加样器: 0.5-10ul, 2-20ul, 20-200ul, 200-1000ul 2.吸头: 10ul, 200ul,1000ul 3.酶标仪: 450nm 4.双蒸水或去离子水, 坐标纸等 * 最新课件 第四.三部分: 实验方法与步骤 1、提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应重复使用。 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可做预实验，以确定稀释倍数)。 * 最新课件 第四.三部分: 实验方法和步骤 5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回4℃ 6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90分钟。 7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。 * 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 最新课件 酶联免疫吸附实验(ELISA) 山东省医学科学院基础所免疫室 * 最新课件 第一部分: 基本实验原理 基本原理 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原进行反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分，然后加入酶的作用底物催化显色，进行抗原或抗体的定性或定量检测。 * 最新课件 第二部分: 常用实验方法 一、间接法 此法常用于测抗体。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物显色进行测定（图1）。 * 最新课件 图1: 间接法测抗体示意图 固相抗原 待测标本(含相应抗体) 酶标抗抗体 * 最新课件 第二部分: 常用实验方法 二、双抗体夹心法 此法常用于测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和底物显色进行测定（图2）。 * 最新课件 图2: 双抗体夹心法测抗原示意图 * 最新课件 第二部分: 常用实验方法 三、竞争法