RACE原理及实验步骤说课材料.pptVIP

5’ RACE流程图 五、cDNA 末端的快速扩增(RACE) 主要步骤： 1、PCR 反应混合液的准备：确保混合液体积足够所有的PCR反应和一次额外的反应。该混合液用于5- 和 3-RACE 反应。 对于50-μl PCR 反应，所混合的成份如下： 2、漩涡混合（不要产生气泡），短暂离心。 * 如果RNA是非人类的，可以跳过此步? 如果特异引物不产生重叠可以跳过此步。 3. 对于 5-RACE: 按表III准备PCR反应； 　 在0.5-ml PCR 管中按顺序加入所有成份，轻柔混合。 * 如果RNA是非人类的，可以跳过此步? 如果特异引物不产生重叠可以跳过此步。 对于 3-RACE: 按表IV准备PCR反应 在0.5-ml PCR 管中按顺序加入所有成份，轻柔混合。 4. 每管内覆盖2滴矿物油，加盖。 Note:.如使用热盖循环仪则不必加矿物油。 5. 使用下列程序之一启动循环仪， (programs 1 和 2 用于5- 和 3-RACE TFR和 UPM Primers的阳性对照)。依据所使用的是poly A+ 还是总RNA来选择正确的循环次数。 六 、RACE 产物的鉴定 RACE 产物的鉴定使用3种方法： (A) 对比用GSPs 和 NGSPs得到的RACE产物； (B) Southern blotting； (C) 克隆和测