引物设计原理.pdf

引物设计原则： 1。长度 一般为 15-30bp ，常用的是 18-27bp ，但不能大于 38 ，因 为过长会导致其延伸温度大于 74 ℃，即 Taq 酶的最适温度 2 。碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过 5 个 GC 含量一般 40-60% GC 含量太低导致引物 Tm 值较低，使用较低的退火温度不利于提高 PCR 的特异性 GC 含量太高也易于引发非特异扩增。 3 。引物 Tm 值 一般要求： 55 ℃-65 ℃。 计算： 对于低于 20 个碱基的引物，Tm 值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T) 来粗 略估算 对于较长引物， 值则需要考虑热动力学参数，从 最近邻位 的计 Tm “ ” 算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15 4 。引物二级结构 引物二聚体 尽可能避免两个引物分子之间 3’端有有较多碱基互补 发夹结构 尤其是要避免引物 3’端形成发夹结构，否则将严重影响 DNA 聚合酶 的延伸。 5 。引物 3’端 引物的延伸从 3’端开始，因此 3’端的几个碱基与模板 DNA 均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致 PCR 扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物 3’端最 后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。 6 。引物 5’端 引物 5’端可以有与模板 DNA 不配对碱基，在 5’端引 入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列 （酶切位点5’端加上适当数量的 保护碱基）。 端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变 5’ 以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 6 。引物的内部稳定性 过去认为，引物 3’端应牢牢结合在模板上才 能有效地进行延伸，故 3’端最好为 G 或 C 。 现在的观点认为，引物的 端应是相对稳定结构，而 端在碱基配 5’ 3’ 对的情况下最好为低稳定性结构，即 3’端尽可能选用 A 或 T ，少用 G 或 C 。 仅仅 3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难 以有效引发引物延伸的。 如果 3’端为富含 G 、C 的结构，只需 3’端几个碱基与模板互补结合， 就可能引发延伸，造成假引发。 7 。引物的保守性与特异性 保守性：通用引物 —— 检测同一类病原 微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增 PCR 引物又称为寡核苷酸引物，也就是 RNA ，是由人工合成的，PCR 引物通常是一对，引物 1 和引物 2 。由于 DNA 聚合酶只能从核苷酸 链的 5'端到 3' 端进行复制，也就是只能识别 3' 的尾端，而且只能把 核苷酸连到已经和 DNA 模板互补产生的多核苷酸链上，所以引物 1 和 2 分别于双链 DNA 的两条链的尾部（就是末尾是 3'端的那一边） 结合，为那些脱氧核苷酸提供 3' 的末端，就相当于开了个头。然后在 DNA 聚合酶的作用下合成两条新链。而那段引物就成了新链的一部 分。 其实在生物体内的 DNA 复制也是这样的一个过程，只是引物是人体 自身合成的 引物设计原则 * 序列选取应在基因的保守区段 * 避免引物自身或与引物之间形成 4 个或 4 个以上连续配对，避免引 物自身形成环状发卡结构 * 典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特 性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于