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第二讲 沉淀分离技术 2 学时 ※、通过本章学习应掌握的内容 1、什么是沉析？ 2 、沉析法纯化蛋白质的优点有哪些？ 3 、沉析的一般操作步骤是什么？ 4 、何谓盐析？其原理是什么？ 5 、盐析操作时常用的盐是什么？ 6 、影响盐析的主要因素有哪些？ 7 、有机溶剂沉析法的原理是什么？ 8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 9 、等电点沉析的工作原理是什么？ 10、其它常用的沉析方法有哪些？ 一、沉淀分离的目的及其方法 沉淀分离技术是经典的化学分离技术 。沉淀的概念是指溶液中的介质在适当 条件下由液相变成固相而析出的过程。 沉淀技术的目的包括两个：⑴通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质的目的。 当目标成分是以固相形式回收时，固液分离可除去留在溶液中的非必要成分； 如果目标成分是以液相形式回收时，固液分离可使不必要的成分以沉淀形式 去除。⑵通过沉淀可使已纯化的产品由液态变成固态，有利于保存和进一步 的加工处理。 沉淀分离技术通常包括下列各种沉淀方法： ⑴无机沉淀剂沉淀分离法：通常是以盐类作为沉淀剂的一类沉淀方法，如盐 析法 ，多用于各种蛋白质和酶类的分离纯化，以及某些金属离子的去除。常 用的沉淀剂有：硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化纳等。 ⑵有机沉淀剂沉淀分离法：以有机溶剂作为沉淀剂的一种沉淀分离方法， 多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离；有时也用于蛋白质的沉淀和 金属离子的去除；用于酶的沉淀分离时，易导致酶的失活。常用到的沉淀剂 有：丙酮、乙醇、甲醇等。 ⑶非离子多聚体沉淀剂沉淀分离法：采用非离子型的多聚体作为目标成分的 沉淀剂 ，适用于生物大分子的沉淀分离，如酶、核酸 、蛋白质 、病毒、细菌 等。典型的非离子型多聚体是聚乙二醇 （PEG），根据其相对分子量的大小 ， 有 PEG600 、PEG4000 、PEG20000 等型号。 ⑷等电点沉淀法：主要是利用两性电解质在等电点状态下的溶解度最低而沉 淀析出的原理。适用于氨基酸、蛋白质及其它属于两性电解质组分的沉淀分 离，如大豆蛋白“碱提酸沉”的提取方法。 ⑸共沉淀分离法：又可称为生物盐复合物沉淀法，用于多种化合物特别是一 些小分子物质的沉淀。它是利用沉淀的同时对其它待分离成份吸附共沉淀而 达到除杂的目的。 ⑹变性沉淀分离法：又称为选择性变性沉淀法，是利用特定条件使目标成分 变性，导致其性质的改变如溶解度下降而得以分离。适用于一些变性条件下 差异较大的蛋白质和酶类的分离纯化。采取的变性条件有 pH 值、温度的改 变以及添加剂、利用酶的作用等，腐竹的生产是利用大豆蛋白的热变性而进 行分离的一个例子。 二、沉析的特点 操作简单 、经济、浓缩倍数高，但针对复杂体系而言 ，分离度不高 、选择性 不强。 三、沉析操作的一般过程 1、在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； 2 、沉淀物的陈化，促进晶体生长； 3 、离心或过滤，收集沉淀物； 四、无机沉淀剂沉淀分离法 一些金属离子的各种盐类形式，如硫酸盐、碳酸盐 、草酸盐等，其溶解度 都很小。所以 ，当添加适当的无机沉淀剂形成上述各种化合物时，便会形成 沉淀，使金属离子得以分离；另外，大部分蛋白质等生物大分子都可以通过 在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程称为“盐析”。这节重点介绍盐析 法。 2.1 盐析法 盐析分离法应用最早和最广泛的是在蛋白质和酶类的分离工作中，用盐析法 分离蛋白质已有 80 多年的历史。由于其它分离技术的出现，盐析法在选择 性方面显得有些不足，但是在粗提纯阶段，盐析法至今仍普遍得到应用。 2.1. 1 盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态： （1）两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散 系 （2）蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞 3 、盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—在低盐浓度下，蛋白质和酶类的溶解度随着随着盐的浓 度提高而增大，这个过程称为盐溶。这主要是中性盐离子对蛋白质分子表面 活性基团及水活度的影响： （a）无机盐离子在蛋白质表面上吸附，使颗粒带相同电荷而互相排斥。