显微注射针的制作.docVIP

[注射针的制作] 注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管，它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。用拉针仪（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具体操作程序详见产品说明书）可以把注射针水平或垂直扯下来。必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置。一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的。另外，应该对拉针仪的设置进行选择，使细丝温度和扯拉力度(主拉力和次拉力)将处于最佳状态。具体需要预实验来确定其最佳设置。待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒。严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸、泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用Narishige Japan model PN-30。 [持卵管制作] 为避免机械损伤，持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限，使受精卵轻轻依附在负压管道中。这种高度密实可抵抗密封系统的破损，而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动。持卵管的口部应该光滑，平整及与其长轴垂直。具体制备操作：双手执毛细玻璃管的两端，将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰，同时双手外伸，将烧软的部分拉细。用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开，在镜下观察切口应平齐(如不平齐，应重新切割)。然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理(即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧，然后于显微镜下检查管口形状，如此反复，直至满意)。如实验室配有持卵管制作仪，则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状，及时调整二者之间的相对位置，更易得到满意的持卵管。持卵管应该做调整，用熔断仪将其打弯使其末端成15度(不同的显微注射仪度数可能有差异,打弯成25度左右,一般为20-25度)轻微弯曲以方便使用。此持卵管为不含细丝的玻璃，显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140?m。持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50?m左右,内径要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管内。为便于操作，持卵管可进一步调整使其末端轻微弯曲（15度）。 [洗卵管制作] 1） 点燃酒精灯，调节火焰到最佳。捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。 2） 当吸管开始变软，快速撤离火焰，向外急剧扯拉使吸管变长，形成口径大约200?l的吸管。注意制备过程中离开火焰的时间以及扯拉的力度，尽量保证制备吸管的一致性。 3） 为吸管评分，轻柔地折断吸管，辨别其声音是否清脆，或扯拉吸管或只做弯曲直到两根同分数的吸管断裂为止。 4） 解剖镜下(要在熔断仪上)检查吸管，并对其进行调整，确定其口径以及管口光滑平整。 [移卵管的制作] 用于转移注射后受精卵到假孕鼠体内的吸管制作过程同上洗卵管。不同的是，这些吸管的口径稍微小一些，大约150?m(150-160?m)，直径比单受精卵的口径略大一些，将促使卵细胞精细的充满移卵管并转移到输卵管。移卵管在打磨过程中要求管口更光滑平整以减轻插入输卵管时对输卵管的损伤，同时必须注意移卵管头在火焰上时间不可太长，防止融化堵塞。管口要平且要钝化。 [凹玻片的准备] 必须准备适合承载用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培养皿做注射槽，载玻片上的受精卵应该浸润在pH缓冲工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保护。具体凹玻片的准备程序如下： 1） 在超净台内利用手动移液器将M2溶液加入凹玻片窝的基底部形成直径大约0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液体的折射效应。吸取胚胎实验用矿物油于M2溶液上，矿物油的量以刚刚达M2溶液最高液面为宜，将凹玻片置于倒置显微镜的载物台上，在低倍镜下调节焦距，使M2溶液液滴的底面清楚为止。 2） 覆盖矿物油的作用：防止液滴脱水以及浓缩；使受精卵处于无菌状态； 固定M2溶液液滴。 3） 从孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗涤2-3次，调整实验用量，将其置于凹玻片的M2溶液中，调焦使在低倍镜下清楚地看到受精卵的轮廓，并且保证受精卵有足够空间自由移动，用持卵器将卵汇聚到一起，移卵时注意不要将气泡移入，影响操作视野。 [显微注射设备] 显微注射仪的基本工作原理是运用立体倒置相差显微镜进行观察监测，显微镜两侧各置一台显微操作仪，一侧接持卵管，另一侧接注射针，可调节持卵管或注射针的空间位置。持卵管通过塑料管连接一个装满矿物油的带微调的注射器，通过调节压力控制卵的运动。注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪。将注射时间与压力固定后，进行注射操作。操作系统有LEICA AS TP基因转殖操作系统（major instruments.co.Lt