十七烟草原生质体融合.pptVIP

* * 实验十七 （2）烟草原生质体融合 一、原理 PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上PEG渗透吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。 在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电荷的不平衡和发生重新分布；在原生质体 吸水过程中，发生原生质体融合。 二、实验目的 学习植物原生质体融合的方法，为进行体细胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。 三、实验材料和用具 1、材料：烟草BY2愈伤组织，烟草组培苗 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛（?=54?m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离心管，血球记数板。 四、实验步骤 1、配制酶液 各组（2人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。 CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶 +0.5%离析酶 2～3周龄愈伤组织和叶片各约1g和0.5g，叶片剪成细条 加入到酶液中、用镊子分散愈伤组织 黑暗、 25℃酶解5~6小时，间歇轻轻摇动。 2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离 3、过滤和离心洗涤原生质体 过滤 800rpm离心3min 弃上清液 加入3ml CPW培养