医学2011生化与分子生物学实用技术课幻灯.pptVIP

以构建 pBSK-Akt1-WT 重组体为例 一、 PCR 扩增得到 Akt1/PKB 的 cDNA 设计基因特异性引物 a 、 b ，以克隆在质粒 pCIS2-Akt1 上的 Akt/PKB cDNA 为模板5 端 引入 Hind Ⅲ 酶切位点，3 引入 Bam HI 酶切位点，以 a 、 b 为引物，扩增野生型 Akt1/ PKB 。 ? 引物 a ( 划线部分为 Hind Ⅲ酶切位点 ) ： ? 5′ - GCGAAGCTTCCATGAACGACGTAGCC ATTGT- 3′ ? 引物 b( 划线部分为 Bam HI 酶切位点 ) ： ? 5′ - ATTGGATCCTCAGGCTGTGCCACTGG CTGAG- 3′ PCR 产物末端限制酶切位点的切断情况 10 × PCR 反应缓冲液 5.0 ? l dNTP mix(2mmol/L) 4.0 ? l Ex Taq DNA 聚合酶 (5U/ ? l ) 0.25 ? l 引物 a (10pmol/ ? l ) 2.0 ? l 引物 b (10pmol/ ? l ) 2.0 ? l pCIS2-Akt1