生物制药工程-重组人干扰素生产工艺.pptVIP

生物制药工程 主讲教师： 刘 凯 liukai_1982@163.com 山东农业大学生命科学学院微生物系 第七章 重组人干扰素生产工艺 7.1 干扰素概述 7.2 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 7.3 重组人干扰素的发酵工艺过程 7.4 重组人干扰素的分离纯化工艺过程 7.1.1 概述 细胞因子（cytokine）是指有机体细胞合成和分泌的小分子多肽，可调节机体的生理功能，参与各种细胞的增殖、分化、凋亡和行使各种功能。 细胞因子在某些情况下还可产生病理作用，参与自身免疫病、肿瘤、移植排斥、休克等疾病的发生和发展。 干扰素（interferon，IFN） 干扰素的发现 就像弗莱明发现青霉素一样，干扰素的出现也充满了神奇和偶然色彩， 50年代之前由病毒造成的传染病大流行严重影响了人类的健康，仅1918年的一次全球爆发的流感大流行就造成了4千万人的死亡，此外天花、麻疹、脊髓灰质炎等病毒引起的传染病也是非常流行，然而，人类一直没有找到一个象对抗细菌感染一样对抗病毒的有力武器，索性当时免疫学的发展促成了人类疫苗的研制成功，通过疫苗人们成功的抵御住了天花、麻疹、脊髓灰质炎的侵袭，然而，对于流感病毒感染却一直没有取得很好的突破，由于流感病毒容易变种的原因，流感疫苗一直未能研发成功，但仍有很多科学家在不遗余力的进行着流感病毒疫苗及其免疫接种等相关的研究。 1957年，英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员Jean Lindenmann，在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰(interfere)病毒的复制，故将其命名为干扰素(interferon)。 1966-1971年，Friedman发现了干扰素的抗病毒机制，引起了人们对干扰素抗病毒作用的关注，而后，干扰素的免疫调控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗肿瘤作用逐渐被人们认识。 1976年，Greenberg等首先报道用人白细胞干扰素治疗4例慢性活动性乙肝，治疗后有2例HBsAg消失。但是由于人白细胞干扰素原材料来源有限，价格昂贵，因此未能大量应用于临床。 　 1980-1982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，从每1 L细胞培养物中可以得到20~40 ml干扰素。从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进入了工业化生产，并且大量投放市场。 天然干扰素的分类与命名 根据国际干扰素命名委员会的建议，天然IFN一般首先按动物来源分类，例如人干扰素(HuIFN)，牛干扰素(BovIFN)等，然后再按IFN的抗原特异性和分子结构分成不同的型别，加以命名。 天然干扰素种类繁多，分子量也不同，亦有不同的抗原性。目前了解由人的不同细胞产生的干扰素至少有三种不同的抗原成分：白细胞干扰素抗原(Le)、人成纤维细胞干扰素抗原（F）和T淋巴细胞干扰素抗原（T）。 根据世界卫生组织规定，将人细胞所产生的几种干扰素，按其抗原性不同分为α、β和γ三类，Le干扰素即为α-干扰素（IFN-α），F干扰素为β干扰素（IFN-β）。T-干扰素即γ干扰素（IFN-γ）。 通过核酸内切酶切割分析，从而搞清了其全部核苷酸的顺序，由此又推导出全部核苷酸顺序，在α、β与γ三型干扰素中又因各型中又有氨基酸的顺序不同，又可分为若干亚型。 IFN-?，由白细胞产生，有25种不同的亚型 IFN-?，成纤维细胞产生，4种亚型 IFN-?，活化的T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)产生，4种亚型 根据对酸和热稳定性，将干扰素分为I型和II型：pH2.0，56℃，1h，有活性的为I型。 I型干扰素：IFN-α、IFN-β、IFN-ζ、 IFN-ε 、IFN-ω II型干扰素：IFN-γ α干扰素 β干扰素 IFN-α和IFN-β 具有许多相似的生物学和生物化学性质，核苷酸序列的同源性高达80％，氨基酸水平的同源性约为25%~30 ％ 。 天然人IFN-β由166个氨基酸组成，分子量23kDa。 成熟IFN-β有20％糖基（第80位有一个N-连接糖基化位点）。 有3个半胱氨酸（Cys），其中第31位和141位Cys之间形成的二硫键，与分子的正确折叠和功能有关，对于其生物学活性非常重要。 γ干扰素 IFN-γ虽然基因序列、氨基酸组成和来源与INF-α和IFN-β完全不同、但生物学活性有许多相似之处。 N端23个氨基酸为信号肽，在分泌出细胞时被切除，活性产物由143个氨基酸组成，分子质量为16 kDa。 IFN-γ分子中没有形成二硫键的半胱氨酸，其活