MIC测定实验的注意事项.pptVIP

一、MIC测定方法 1常量液体稀释法：试管法 2微量液体稀释法：96 孔板上进行 3 E试验(E-test) ：浓度梯度琼脂扩散试验 常量液体稀释法 MIC测定的意义 进行水产病原菌耐药性监测，指导养殖户科学合理用药 二、临床细菌药敏实验标准—CLSI CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）美国临床实验室标准化研究所 前身为NCCLS美国临床实验室标准委员会，2005年起更名为CLSI 其抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准，是国内临床细菌检验遵循的标准，已经被我国卫生部指定为部颁标准 CLSI介绍 文件： M100-S20 抗微生物药物敏感性试验执行标准（2010） M02-A10　纸片扩散法（2009） M07-A8　 MIC方法　（2009） 文件的变更： M100每年更新一次 M02、M07每三年更新一次 水产病原菌药敏试验标准-探讨中 国内外水产细菌药敏试验还未有公认的标准化参考方法 1998年：欧盟水产工作组、NCCLS水产工作组(VAST-AWG)成立 2003年：NCCLS 颁布水产第一类型病原菌纸片琼脂扩散法敏感试验标准方法报告(M42-R) 2003年：日本动物抗菌药物协会(JSAA)MIC测定方法标准化委员会制定动物病原菌耐药性和检测指导方案 三、培养基的选择与配制 水解酪蛋白(MH):CLSI 、JSAA等推荐的标准培养基，也是最常用的药敏试验培养基，包括水产病原菌药敏试验 需氧菌及兼性厌氧菌在MH中生长良好 MH肉汤配方：牛肉浸粉?5g，酪蛋白水解物?17.5g，淀粉?1.5g，蒸馏水1L，pH7.4±0.2 ，121℃高压灭菌15分钟 MH固体配方：同上，多加琼脂15g 四、药物的预溶和稀释 原因：不同的药物溶解性不同 意义：正确溶解和稀释药物才能最大限度发挥药效，是保证药敏实验成功的前提 方法：参见《2010年药物敏感性试验解释标准中文版M100-S20 》，p117 注意：标准只是借鉴，具体操作需要实践摸索 实践 1溶解方法改善： 但是用这种方法溶解不了，建议直接用少量的1 mol/L NaOH预溶，然后补足生理盐水 2 动物专用药：需查《新编渔药手册》、《中国兽药典》 、文献等，如氟苯尼考需用二甲基甲酰胺(DMF)溶解，无菌生理盐水稀释 五、药物的保存 建议：药物现用现配 依据：《中国兽药典》及相关文献如《枯草芽孢杆菌金霉素耐药基因转移研究》，不同的药物保存寿命不同 一般：4℃ 避光保存7d，-70 ℃ 避光保存1~2月 六、药物梯度的选择 依据：日本化学疗法学会制定的标准法（1975） 原则：根据药效来选择，药效强，稀释倍数需多，需有阳性和阴性对照 方法：建议先做预实验，了解药效 七、小结 1 MIC测定方法：常量液体稀释法、微量液体稀释法和E试验 2 水产药敏实验标准：靠在座各位制定 3 培养基规范化：MH培养基 4 药物的预溶和稀释：不同药物不同 5 药物的保存：建议现用现配 6 药物梯度的选择：根据药效来定 八、思考问题 1 MIC测定的意义？ 2 药敏实验培养的温度和时间？ 3 细菌耐药机理和药物杀菌机理？ MIC测定实验的注意事项 王美珍 mickeyfj@webmail.hzau.edu.cn 水产养殖用药物敏感性实验技术培训 讲课内容 一、MIC测定方法及意义 二、药敏实验标准 三、培养基的选择与配制 四、药物的预溶和稀释 五、药物的保存 六、药物梯度的设置 七、小结 八、思考问题 先灭再分or先分再灭？ 过滤目的？ 常量液体稀释法测MIC 最小抑菌浓度（MIC） :培养5d，与未加菌液的空白对照组比较，肉眼观察证实无菌生长试管中最低药物浓度即为MIC 1-13试管中药物浓度：100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05和0.025μg/mL 水 先加入1/2的水，然后加0.1mol/L NaOH，逐滴加入溶解 诺氟沙星 稀释液 溶剂 抗微生物药物