动物组织中总RNA的提取.ppt

* * 实验二 动物组织总RNA的提取 1.关于RNA:rRNA(80-85%)5S,5.8S,18S,28S 120,160, 1874,4718个核苷酸组成 tRNA(15-20%) 70~90个核苷酸组成 mRNA(1-5%)1.5-2.5kb 一．原理： 2.用途: 体外蛋白质的生物合成 Northern 杂交:主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的 mRNA 分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。 通过RT-PCR建立cDNA文库 通过寡聚脱氧胸苷（OligodT）制备mRNA 由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligodT纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→溶解RNA→鉴定RNA → 保存RNA 1、 破碎组织:可以用盐酸胍、异硫氰酸胍、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性 3.原理 2、 分离RNA:一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开 3、 沉淀RNA:一般用乙醇、3M NaAc或异丙醇 4、 洗涤RNA:使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。 5、 溶解RNA一般使用TE。 6. 鉴定RNA: 6. 鉴定RNA: 紫外吸收法: 浓度:OD260=1时,RNA为40ug/ml 纯度:OD260/OD280=1.8-2.0 小于1.75:蛋白质污染 大于2.0 :DNA,有机溶剂污染 7、 保存RNA:应该尽量低温 为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。 二.操作步骤: (一).总RNA的提取 1.匀浆(准备室准备):裂解组织细胞, 使RNA酶失活, 使核酸从核蛋白中解离出来(RNP=PNA+Pr.) 2.取1ml匀浆液至消毒的1.5ml的eppendorf管中,加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15sec,室温放置3min,12000rpm离心10min 3.吸取上层水相转移至干净的eppendorf管中,加入等体积异丙醇,混匀,室温放置20min 4. 12000rpm离心10min,弃上清 5.加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀. 12000rpm离心3min,弃上清,室温干燥5-10min 6.加入30-50ulRNase-free ddH2O,充分溶解RNA。将所得RNA溶液置于-70度保存待用 (二).鉴定（1.5%琼脂糖电泳鉴定） 1、制胶：1.5%琼脂糖加热溶解冷到60℃加EB后倒入制胶板中，待凝胶固化 2、加样：15ulRNA提取液+3ul loading buffer 3、电泳80-120v,30分钟 4、紫外灯下观察结果 操作