基因工程目的基因的分离.ppt

第五章 基因工程 目的基因的分离 第一节 基因工程的工具酶 一、限制性核酸内切酶 2、限制性核酸内切酶的类型 （2）Ⅱ型限制性核酸内切酶 3、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特点 b、3′突出粘末端 B、平端 （3）Ⅱ类限制一修饰系统的甲基化酶 4. 限制性核酸内切酶的特异特点 （2）同尾酶 5、限制性核酸内切酶的命名 6、限制性核酸内切酶识别序列的长度与识别位点的频率 二、DNA连接酶 三、DNA聚合酶 五、末端脱氧核苷酸转移酶 六、T4噬菌体多核苷酸激酶 七、碱性磷酸酶 八、S1核酸酶 九、Bal31核酸酶 第二节 目的基因的分离 一、化学合成法 三、基因文库分离目的基因 （一）基因组文库的建立 基因组文库应具有的克隆子数 （二）、cDNA文库的建立 1、mRNA分离 3、第二条链的合成 （三）在cDNA文库中分离基因 四、mRNA差别显示分离目的基因 五、利用转座子分离目的基因 六、基因芯片技术分离目的基因 * * 限制性核酸内切酶（简称限制酶 restriction enzyme），是指在细胞内能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并在此位点对DNA分子进行切割的一种内切酶。 1952年，Luria和Human发现宿主控制性限制现象。 1、 限制—修饰系统 包括限制酶和甲基化酶。1968年，Meselson和Yuan，Linn和Arber从E.coli菌株K和B中发现了Ⅰ型限制性核酸内切酶，接着，Smith和Wilcox于1970年分离纯化了第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶。 宿主细胞对噬菌体感染的限制-修饰作用 Ⅰ型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。Ⅰ型酶需要Mg2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因子。切割方式也很奇特，它结合在识别位点，以滚环方式沿DNA转位，而后距其识别位点5侧数千个碱基处随机切割。 III型酶与Ⅰ型酶基本相似，但是III型酶具有特异性的切割位点，在识别点的3’—端24～26bp处。 它的切点与识别位点是一致的。由于Ⅱ型酶的该特点，且反应中不需要ATP、S-腺苷甲硫氨酸作为辅因子，因而是基因工程中使用的主要工具酶。 （1）Ⅰ型和III型限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶分为3种类型：I型、II型和III型 （1）识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，其长度一般为4～8个核苷酸，且具有双重旋转对称的结构形式。 其中，大写字母代表核苷酸碱基，带撇的大写字母则代表互补的核苷酸碱基，N是代表任意一种核苷酸，垂直线代表对称轴。 （2）具有特定的酶切位点 A、粘性末端 a、5′突出粘性末端如限制酶Pst-Ⅰ,它识别6核苷酸序列，产生4核苷酸5’-粘性末端序列。 5’ -C↓TCGAG- 3’ 5’ -CTCGA- -G- 3’ 3’ -GAGCT↑C- 5’ 3’ -G- -AGCTC- 5’ ? ? A′B′C C B A A′B′N′B A A′B′ B A A B C C′ B′ A′ A B N B′A′ A B B′A′ 如：从流感噬血菌（Haemophilus influenzae）分离出来的一种限制酶，其识别序列和切割位点为： 5′-A↓AGCTT- 3′ -5’-A- -AGCTT-3′ 3′-TTCGA↑A- 5′ -3’-TTCGA- -A-5′ 例限制酶Hae III，它识别4核苷酸序列，切割点产生平口末端。 5’ -CG↓CC- 3’ 5’ -GG- -CC- 3’ 3’ -CC↑GG- 5’ 3’ -CC- -GG- 5’ 维持维持性甲基化酶：指新合成的DNA链上的甲基化与模板DNA链上的甲基化位置相同。 构建性甲基化酶：该酶可在非甲基化的DNA链上新甲基化。 1（1）同裂酶 来源不同但识别相同核苷酸序列并有相同切割位点和形成同样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。 如：HpaⅡ和MspⅠ，它们的识别序列均为CCGG，切割位点均为C↓CGG。有些同裂酶对切割位点是否与甲基化的敏感性不同。在不含有甲基时，HpaⅡ和MspⅠ均可对其切割，如果胞嘧啶被修饰为5-甲基胞嘧啶，则MspⅠ可以切割它，而HpaⅡ就不能切割此序列。 来源不同，识别的核苷酸序列也不同，