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ELISA技术在检测中的应用 及数据分析软件应用 刘平 2010.3.12 目录 ? ELISA技术基本原理 ? ELISA技术在食品安全检测中的应用 ? ELISA试剂盒数据分析 ? 标准曲线 ? 分析软件的详细介绍和数据判定经验分享 1 ELISA原理 ? ELISA的定义 ? ELISA的类型 ? ELISA技术的特性 ? ELISA技术必备的几个基本试剂 ELISA中常用名词 ? ? 半抗原 灵敏度 ? 精密度 ? 抗原 ? 检测限 ? 载体 ? 定量限 ? 抗体 ? 半定量 ? 稳定性 ? 标准曲线与线性 ? 特异性 ? IC50 ? 准确度 2 食品安全检测中的应用 ? 在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本 中的残留物的药物和微孔条上预包被的偶 联抗原竞争抗体，加入酶标二抗后，用 TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留 物的含量成负相关，与标准曲线比较再乘 以其对应稀释倍数即可得出样本中药物的 残留量。 检测项目 ? 兽药残留抗生素分析；如氯霉素、硝基呋喃类、四环素类 等。 ? 有害添加物；如孔雀石绿、结晶紫、吊白块、三聚氰胺等。 ? 毒素；如生物毒素、食源性致病菌、细菌毒素、真菌毒素 等。 ? 微生物：如沙门氏菌、李斯特氏菌、致病性弧菌、弯曲杆 菌等。 ? 激素：如已烯雌酚、睾酮等 ? 农药残留 ? 转基因食品 ? 食品过敏原 ? 其他 3 ELISA检测流程 先 加 后 加 混匀 洗 板 拍 H2SO4 A液 先 加 B液 后 加 干 酶 显色 洗 酶 酶 酶酶酶酶酶酶酶 酶酶 酶 板 酶 酶 酶酶酶酶酶酶酶 酶酶 酶 酶 酶 酶 酶酶 酶 酶 酶酶 酶 酶 酶 酶 酶 注意事项 ? 实验前 ? 实验中 ? 实验后 4 数据分析 ? 结果判定有三种方法，简单判定可用第1种 方法，粗略判定可用第2种方法，定量判定 用第3种方法。注意样本吸光值与药物的含 量成负相关。 判定方法一 标准1 标 准 品 显 色 情 况 标准2 标准3 标准4 标准5 样本1的显色情况可以看 出大概在标准2与标准1的 颜色之间，即可得出其样 本中的待测物含量在标准 1与标准2之间，再乘上样 本的稀释倍数以后即可得 出该样本的最终含量范围。 标准6 同理可以看出样本的 检测含量在标准5与 标准6的浓度之间， 样本1 再乘上样本的稀释倍 数以后即得到该样本 的大概含量。 样本2 5 判定方法二 ? 用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其 浓度范围(ppb)。例如样本1的吸光度值为0.236， 样本2的吸光度值为0.666，标准品吸光度值分别 是： 0ppb为1.949；0.05ppb为1.434；0.15ppb 为0.939；0.45ppb为0.487；1.35ppb为0.157； 4.05ppb为0.060。则样本1的浓度范围是0.45ppb- 1.35ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中 药物残留的浓度范围；样本2的浓度范围是 0.15ppb-0.45ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得 出样本中药物残留的浓度范围。 判定方法三 百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光 率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值 （双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值， 再乘以100%，即 百分吸光度值（%）＝（B/B0）×100% 标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以被检测药 物的标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制 标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线 中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以 其对应的稀释倍数即为样本中药物的实际浓度。 6 坐标轴 标准曲线 ? S形曲线：是典型剂量反应曲线，多见于剂 量－质反应关系中，分为对称S形曲线和非 对称S形曲线两种形式。 ? 直线：化学物质剂量的变化与反应的改变 成正比。 ? 抛物线：为一条线陡峭后平缓的曲线，类 似于数学中的对数曲线，又称为对数曲线 型。 7 拟合曲线 ? 用于免疫检测的所谓“标准曲线”其实称为拟合曲 线比较合适。免疫检测时标准点（可以是倍比稀 释的，也可以不是）浓度如果和相应的吸光度 （OD）值如果能够呈现直线关系当然是最理想的 了，这时可以通过EXCEL等方便的获得拟合曲 线，进而推算出样品的浓度值。但我们做免疫检 测很少有时候能够有这么理想的情况，标品浓度 和相应OD值往往是S型的曲线关系，这时就不 能用直线拟合的方式了，而对拟合方法进行选择 就是必要的了。 曲线拟合方式 ? 关于标准曲线的拟合方式，直线、二次曲线、三次曲线、 指数、对数等虽都可用于ELISA及其它生物学反应中的曲 线拟合，但都只适用于曲线的一部分，有的适用于前半 段，有的适用于后半段，有的适用于中间一段，而 Logi