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Western Blot基本原理及操作 中山医院临床医学研究院 侯嘉云 hou.jiayun@zs-hospital.sh.cn Michael A. Milhollen, cancer research, 2011 流程 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白定量 蛋白定量 、 样品准备 样品制备过程中的一些要点与建议 ? 收集细胞离心时转速需适当； ? 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子； ? 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的对蛋白 修饰的改变，制备过程应在低温进行； ? 样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直 接以液体状态置 -80℃中保存，但要注意不要反 复冻； ? 煮样时防止爆管 分离胶凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶制备-分离胶 灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:8% 异丁醇：8% 浓缩胶(5%) 凝胶制备-积层胶 灌制积层胶 插入梳子 制备凝胶中的要点 ? AP要新鲜配制； ? 混合搅拌速度太快易产生气泡影响聚合， 导致电泳带畸 形，太慢不均匀； ? 分离胶勿倒的过满，需留一定的空间； ? 凝胶需缓慢凝固，TEMED、AP用量过多会导致胶太硬， 从而电泳时易烧胶 ? 保持所有装置清洁； ? 试剂要有正确的pH值，及妥当的保存 凝胶电泳 上样的注意要： ? 20--50ug总蛋白 或100ng纯蛋白， 可根据蛋白 表达水 平进行优化； Staking gel ? 尽量保持每个泳 道的蛋白量一样， Separating gel 体积尽量一致； ? 样品两侧的及空 置的泳道用等体积 的1×loading buffer上样 ?小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥； 浓缩胶 80v左右，分离胶100v左右 、 转膜 转膜 转膜 转膜 转膜 转膜中的要点与建议 封闭 抗体孵育 抗体孵育 直接法与间接法的比较 直接法 间接法 快速（一种抗体） 额外的二抗孵育以及条件优化 没有二抗交叉反应引起的非特 交叉反应引起的非特异性条带 异性条带 无信号二级放大 信号放大灵敏度高（多个二抗 结合位点） 免疫反应性降低 免疫特异性不受标记影响 对照 内参的选择 ? 目的蛋白分子量 相差5KD以上 ? 实际的试验环境 组织缺氧、糖尿病： GAPDH升高 凋亡及移除核膜： Lamin 骨骼肌：beta-actin 检测方法 常见问题-信号弱或无信号 常见问题-高背景 常见问题-条带位置不对或有非特性条带 常见问题-块状染色 常见问题-弥散 常见问题-条带弯曲 常见问题-其他 安全注意事项 原则 操作有毒试剂，带口罩和手套 操作挥发性试剂应在通风橱中进行 安全注意事项 ? PMSF：苯甲基磺酰氟是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂，它对呼吸道黏膜、眼 睛和皮肤有非常大的破坏性，可因吸入、咽下或皮肤吸收而致命 ? Triton X-100：引起严重的眼睛刺激和灼伤，可因吸入、咽下或皮肤吸收而受害 ? SDS (十二烷基硫酸钠)：有毒，是一种刺激物，并造成对眼睛的严重损伤的危险 ? DTT （二硫苏糖醇）：很强的还原剂，散发难闻的气味，可因吸入、咽下或皮肤吸 收而危害健康，由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差 ? Acr（丙烯酰胺）：具有很强的神经毒性，同时还有生殖、发育毒性，可能具有致 癌性，可通过皮肤吸收及呼吸道进入人体，其作用具有积累性。聚丙烯酰胺无毒， 但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分 ? Bis （甲叉双丙烯酰胺）：有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末 ? AP(过硫酸铵)：对黏膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大危害性。吸入可致命 ? TEMED：强神经毒性，防止误吸，操作时快速，存放时密封 ? NaN3 (叠氮钠)：毒性非常大，阻断细胞色素电子运送系统 谢谢！