RNA提 取方法及原理.pptVIP

* 上层水相含有RNA，中间层为基因组DNA，下层有机相含有蛋白，多糖等杂质。这样我们可以通过不同的方法分别提取得到RNA，DNA和蛋白。 过渡词：我们如何来分离纯化上层水相中的RNA呢？ * PPT模板集编辑说明 本模板文件只是整个模板集的一部分，包含各种风格和用途，后面也会一直陆陆续续的更新，这是模板适合多个场合，按照需要获取，使用灵活方便，排版及各个字体限制已经设置好，可以直接使用也可以自动以使用 * 最新整理文档合集 RNA提取方法及原理 第八组 * 最新整理文档合集 一、研究背景 二、方法及原理 * 最新整理文档合集 1、研究背景 1.1 RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。 * 最新整理文档合集 1.2 RNA分布 不同丰度 组织名称 样品量 总RNA含量 高丰度 肝脏 1mg 2-4μg 脾脏 1mg 心脏 1mg 中丰度 大脑 1mg 0.05-2μg 胚胎 1mg 肾脏 1mg 肺 1mg 低丰度 膀胱 1mg 0-0.05μg 骨 1mg 脂肪 1mg 高丰度 成纤细胞 105 0.5-1μg 人白细胞 105 中丰度 酵母 105 0.5-1.5μg 拟南芥叶片 1mg 0.2-0.5μg 低丰度 烟草叶片 1mg 0.05-0.1μg 玉米叶片 1mg * 最新整理文档合集 2、方法及原理 2.1 RNA的提取流程 1、样本前处理 2、细胞裂解 3、 RNA的纯化及获得 * 最新整理文档合集 RNA提取流程－－ 样品前处理注意点 选择新鲜血液，不得超过4小时 选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞 选择新鲜组织，生长旺盛的组织 * 最新整理文档合集 可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间 去掉培养基，加入一定量TRNzol -70 ℃保存较长时间 推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存 液氮或加入RNase抑制剂中保存， 避免反复冻融 RNA提取流程－－ 样品前处理中如何保存样本 * 最新整理文档合集 RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA 异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂 独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂 胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒 * 最新整理文档合集 RNA提取流程－－ RNA的纯化及获得 RNA纯化要求 1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 2 排除有机溶剂和金属离子的污染 3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除DNA分子的污染 * 最新整理文档合集 2.2 RNA提取的注意事项 2.2.1 杜绝外源酶的污染 一：严格戴好口罩，手套。 二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 * 最新整理文档合集 2.2.2 阻止内源酶的活性 一：选择合适的匀浆方法。 二：选择合适的裂解液。 三：控制好样品的起始量。 * 最新整理文档合集 2.2.3 明确自己的抽提目的 一：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 二：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。  * 最新整理文档合集 2.3 Rnase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶 * 最新整理文档合集 2.4 几种RNA提取方法 2.4.1 TRIzol法 TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 * 最新整理文档合集 TRIzol法提取流程 1 ．