第六章沉淀分离技术-(6).pptVIP

生物工程下游技术 生命科学与生物制药学院 生物技术系 什么是沉淀法？ 沉淀法纯化蛋白质的优点、缺点有哪些？ 常用的沉淀方法包括哪些？ 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 何谓盐析？其原理是什么？ 何谓“Ks”分级盐析法？何谓“β”分级盐析法？ 常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？ 高聚物沉淀的原理是什么？常用的高聚物是什么？ 等电点沉析的工作原理是什么？ 沉淀是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，形成固相从溶液中析出从而达到分离的一种技术。 优点：过程简单，成本低，原料易得，便于小批量生产，在产物浓度越高的溶液中沉淀越有利，收率越高，对大多数生物分子的分离纯化有独特优势。 缺点：过滤困难，对于复杂产品体系，分离度不高，产品质量较低，需重新精制。 主要包括有机溶剂沉淀、盐析、高聚物沉淀和聚电介质沉淀、等电点沉淀等。 沉淀法的原理： 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中溶解度不同而达到分离的目的。 溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生物产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行。 沉淀法操作步骤： ①首先加入沉淀剂； ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。 溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起： ①热运动，布朗运动； ②对流运动，由机械搅拌产生； ③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。 为了简化沉淀过程动力学， 可把沉淀过程分成下述６个步骤： (1) 初始混合 (2) 新相生成 (3) 布朗运动凝集 (4) 机械碰撞凝集 (5) 聚集体陈化 (6) 聚集体沉淀 蛋白质是两性高分子电解质（amphoeric poly－mer），主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。 水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。 亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。 因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。 蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域 蛋白质的溶解特性： 蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周围溶液性质所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。 防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 ⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 ⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。 优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点是1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高 总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。 常用的有机溶剂沉析剂 选择依据： 水溶性要好 介电常数要小 致变性作用要小（甲醇） 毒性要小、挥发性适中 容易获取 　沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 有机溶剂沉淀法的影响因素 1、温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行， 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加