ABO血型的基因型检测教学教材.pptVIP

ABO 血型的基因型检测;一、实验目的与原理;2.原理;IA基因与IB基因之间在cDNA上有7个单碱基替换：A294G、C523G、C654T、G700A、C793A、G800C和G927A。 i基因与IA基因相比只是cDNA的第258位的胞嘧啶缺失，出现框移突变，使第352位的1-rA变成了TAA(终止密码子)，提前终止了转移酶的合成，导致合成的转移酶没有活性区，所以在红细胞膜上没有Ａ，Ｂ 抗原的产生。; 根据genebank上公布的I A 、 IB 、 i 基因序列设计引物，扩增ABO糖基转移酶基因中的2个区段。 引物由上海生工合成，引物序列为： 引物1：5′-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3′ 引物2：5′-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3′ 引物3：5′-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3′ 引物4：5′-CACCGACCCCCCGAAGAA-3′;用1、2引物进行PCR扩增，等位基因IA ， IB产物为200bp，等位基因i (258位G缺失) 产物为199bp。 限制性内切酶kpn I ： i基因PCR产物 199bp 切出171bp＋28bp， IA ， IB基因PCR产物 200bp没有该酶的切点依然是200bp。 用3、4引物进行PCR扩增，等位基因I A 、 IB 、 i的产物均为159bp。 限制性内切酶Alu I ： IB 基因PCR产物 159bp 切出118bp＋41bp， I A 、 i基因PCR产物 159bp没有该酶的切点依然是159bp ;kpnI（1，2引物产物）消化：;Alu I消化(3,4引物产物):;;二、实验用品;三、实验内容与操作;2. DNA提取：DTT- TKM-TritonX-100抽提法 每管样品加入200μL TKM液，混匀，加1滴TritonX-100，混匀， 6000r/min离心5min ，弃上清。 将沉淀溶于40μL TKM液，加3μL 10%SDS，4μL蛋白酶K （0.2 g/L），8μL DTT（4 mol/L），剧烈混匀，55 ℃水浴5min。 加入15μL饱和NaCl（6 mol/L），混匀，13000r/min离心5min。 转移上清约40μL至另一管中，加2.5倍体积95%冰乙醇，- 20℃，30min。 13000r/min离心10min，弃上清，加75%冰乙醇洗1 次，干燥，溶于100μL TE，-20℃保存。;3. 扩增反应：;扩增程序： 1. 94℃预变性5min 2. 94℃变性50s， 3. 60℃退火30s， 4. 72℃延伸60s， 5. 72℃延伸10min 6. 4℃保温。 ;4. 酶切反应：;5.电泳检测： 将酶切产物在3％的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后观察结果并照相。;四、注意事项?;;五、作业与思考题