质粒DNA的提取实验.docVIP

实验六 质粒DNA的提取 一、实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒 二、实验原理 质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS（十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。 三、实验材料与试剂 1、实验材料 大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T） 2、实验试剂 (1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L； (2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)； (3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml； (4) 氯仿－异戊醇（24：1）； (5) 异丙醇、70%乙醇； 四、实验步骤 （一）提取质粒 1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。 2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min 3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm离心1min 4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。 6. 加200μl新配制的溶液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,注意动作一定要轻柔缓和，切勿振荡!将离心管放置于冰上(2min)。 7. 加150μl用冰预冷的溶液III,盖紧管口,反复颠倒数次,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3～5min。 8. 4 ℃以12000rpm离心5 min,将上清液（400 μl 9. 加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）振荡混匀。 4 ℃以12000rpm离心5min，将上清液（300 μl 10. 加2/3体积的异丙醇沉淀质粒DNA,振荡混匀,于冰上放置15min。 11.4 ℃以12000rpm 12. 加1ml 70％乙醇溶液洗涤沉淀，振荡混匀, 4 ℃12000rpm离心5min。弃去上清液，在空气中使DNA沉淀干燥（约5-10 13. 用20μl灭菌的蒸馏水溶解DNA,加1μl胰RNA酶37 ℃消化RNA 30min 14. 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒的提取状况。 五、实验结果 我组为第7组，由电泳图谱可以看出，电泳得到3个条带，条带较为清晰。最前面的一条带为超螺旋的质粒DNA（分子量2000bp），中间的条带为两条链均发生断裂而形成的线形DNA；最慢的条带为一条链发生断裂的开环质粒DNA。 六、思考题 1. 试述在提取质粒过程中溶液I、II、III的作用是什么? （1）溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L； 主要作用是使细菌悬浮，此外EDTA 可抑制DNase的活性。 (2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)； 碱会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA排放到上清中；在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，可被SDS包盖。 (3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml； K+置换了SDS中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾），这些复合物可以从溶液中有效地沉淀下来，经离心除去。 2. 描述质粒DNA的电泳图谱，并解释产生的现象及可能的原因？ 实验中得到的质粒DNA电泳图谱显示共有三条带，其中： 最快的一条带是超螺旋的质粒DNA；中间的是线性DNA，质粒的两条链均断裂形成了线性分子；最远的一条是开环的质粒DNA，有一条链断裂。后两种情况的发生主要是由于在质粒提取过程中，机械力、酸碱度、试剂等的原因，使质粒DNA链发生断裂。