核酸检测技术及质量控制王凤鸣.ppt

PCR实验技术的质量控制要点 高质量无污染无降解的核酸制备 严格实行分区操作 试剂储存和准备区 标本处理和核酸制备区 核酸扩增区 扩增产物分析区 实验人员的操作技能 理想的PCR实验室分区设计模式 产物分析区 空气流向 空气流向 空气流向 空气流向 缓冲间 缓冲间 缓冲间 专用走廊 工作流向 扩增区 标本制备区 试剂准备区 各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作 “十六字口诀” PCR实验室设计的一般原则 标本处理与核酸提取的质量控制 核酸提取试剂的选择 核酸扩增试剂的选择 试剂的分装保存 试剂的配置 对照的设立 核酸扩增仪器 扩增参数的设定 扩增产物的检测与分析 荧光定量 普通凝胶电泳 毛细管电泳 污染的控制和预防 常见污染的来源 控制污染的措施 消除污染的措施 三、实验室生物安全管理 为什么关注实验室生物安全？ 三起SARS疫情后期的实验室感染事件 2003年9月8日：新加坡国立大学实验室，在P3实验室同时开展西尼罗病毒与SARS病毒的研究，一位27岁华人研究员感染； 2003年12月6日：台湾省国防大学预防医学研究所，一名47岁的中校研究员，在P3实验室内清理SARS实验后的废弃物时，未戴手套，因而感染； 2004年4月22日：中国CDC病毒所，跨室开展SARS病毒研究，并引发三代、9例 病例、1例死亡；另有两例 “隐性”感染者。 引起实验室生物污染的原因很多很多 人员生物安全概念薄弱和技术操作不当； 生物安全柜和高压灭菌容器的不正常使用或使用不当； 样品传递、接受和使用、装有冻干感染性物质安瓿的打开； 匀浆器、组织研磨器、摇床、搅拌器和超声处理器的使用； 离心机内装有潜在感染性物质的离心管发生破裂 生物安全的概念 实验室生物安全 避免危险生物因子造成实验室人员暴露、向实验室外扩散并导致危害的综合措施。 生物安全三个方面： 一指人类的健康安全；二指人类赖以生存的农业生物安全；三指与人类生存有关的环境生物安全。 微生物实验室生物安全 三项技术措施 样品隔离技术（机械、气幕)：防止传染因子进入环境接触人体 定向气流技术（负压系统)：防止传染因子扩散 消毒灭菌技术（物理、化学)：灭活传染因子 实验室可以分为 基础实验室 —— 一级生物安全水平 基础实验室 —— 二级生物安全水平 防护实验室 —— 三级生物安全水平 最高防护实验室 —— 四级生物安全水平 根据操作不同危险度等级微生物所需的实验室设计特点、建筑构造、防护设施、仪器、操作以及操作程序来决定实验室的生物安全水平。 实验室生物安全防护屏障 一级防护屏障 生物安全柜和个人防护装备等构成的防护屏障。 生物安全柜 高效空气过滤器 。 李燕 实验室生物安全防护屏障 二级防护屏障 设施结构和通风系统等构成的防护屏障。 “盒中盒”的结构 实验室生物安全防护水平分级 生物安全水平分级 根据生物因子危害程度和采取的防护措施，将生物安全防护水平（biosafety level，BSL）分为4级（BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示）；动物实验室以ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表示。 与一般生物洁净室的区别 1.工作目的 BSL实验室： 保护工作人员和环境为主，也保护产品。安全是首要考虑因素。 生物洁净室：以保护产品（工作对象）为主。洁净是首要考虑因素 2.污染物的种类和来源 BSL实验室：为目标微生物。内部产生。 生物洁净室：粉尘（可能的热源）和微生物。外部进入以及人的活动产生。 与一般生物洁净室的区别 3.空气污染物处理方式 BSL实验室：平面布局和气流流向的作用, 产生环节在一级屏障内进行个体防护。 生物洁净室：主要通过进气净化 减少活动。 4.洁、污概念 BSL实验室：凡有目标微生物即视为污； 凡无目标微生物即视为洁； 对各环节洁、污应仔细分析。 生物洁净室：粉尘、微生物（特别是超标者）和废弃物均视为污。 与一般生物洁净室的区别 5.排气处理方式 BSL实验室：不允许室内 → 室外； 排气须净化，不许回风。 生物洁净室：一般室内 → 室外； 排气可回风。 6.实验室软、硬件的作用 BSL实验室：对工作人员保护，实验室软件应是决定性的； 对环境保护，实验室硬件应是决定性的； 生物洁净室：均很重要，但硬件设施作用比较大。 核酸检测技术及质量控制王凤鸣 核酸检测技术及质量控制 常州市疾病预防控制中心 王凤鸣 目 录 一、PCR实验技术操作要点 二、质量控制要点 三、实验室生物安全管理 一、PCR实验技术操作要