凝胶过滤析法分离血红蛋白.ppt

凝胶过滤层析法分离血红蛋白 化学生物学实验 药学院 化学生物学教研室 1. 实验目的 初步了解凝胶过滤层析 法的简单原理及应用 初步掌握应用凝胶过滤 法分离蛋白质 1 2 2. 实验原理 层析法是利用混合物中各组分物理经学性质的差别（如吸 附力、溶解度、分子形状、大小和极性等），使各组分以 不同的程度分布在两相中，从而使各组分以不同的速度随 流动相向前流动而达到分离的目的。层析法可分为多种类 型，包括分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和 层析等。 层析法 分配层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析 2. 实验原理 1 待分离混合 物（ A 、 B ） 随流动相通 过固定相 由于理化性质 差异，与两相 发生相互作用 （吸附、溶解、 结合等）的能 力不同，在两 相中的分配 （含量对比） 不同 与固定相相互 作用力越弱的 组分，随流动 相移动时受到 的阻滞作用小， 移动速度快 分步收集流出液， 可得到样品中所 含的各单一组分， 从而达到将各组 分分离的目的 2 3 4 凝胶过滤层析，主要根据混合物中分子的大小及形 状不同，在通过凝胶（固定相）时，分子的扩散速 率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性的 网状结构，小分子可以进入凝胶颗粒内部，流程长 而移动速率慢（阻滞作用大）；而大分子则被排除 在外，沿凝胶间空隙随（流动相）流动，流动短而 移动速率快（阻滞作用小），比小分子物质先流出 层析床，所以凝胶过滤层析又称为排阻层析，分子 筛层析，凝胶过滤法操作简例，且操作条件温和， 不易引起生物样品变性失活，分离效果好，故广泛 应用于蛋白质、酶、核酸的分离提纯（包括脱盐、 浓盐及分子量的测定等） 2. 实验原理 本实验通过 sephadexG50 层析柱，以蒸馏水为流动相，分离血红蛋 白（红色，分子量约 64,500 ）与二硝基氟苯 - 鱼精蛋白（鱼精蛋白与 二硝基氟苯结合后为黄色，分子量为 2,000-12,000 ）的混合物，从颜 色的不同即可观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。 2. 实验原理 3. 实验用品 试剂 （ 1 ）交联葡聚糖 G-50 （ 2 ）二硝基氟苯 （ 3 ）鱼精蛋白 （ 4 ） 0.9%NaCl （ 5 ） 10% 碳酸氢钠 （ 6 ） 95% 乙醇 仪器 （ 1 ）锥形瓶 （ 2 ）层析柱（ 1cm × 25cm 的 玻璃柱）（ 3 ）铁架台 （ 4 ）弹簧夹 （ 5 ）细橡皮管（长 2cm ） （ 6 ）量筒 （ 7 ）小烧杯 100ml 4. 操作步骤 1 、凝胶准备： 取 sephadex G-50 3g 置于锥形瓶中，加蒸馏水 90ml ，于沸水浴中煮沸 2 小时 ( 或放于水中浸泡 6 小时 ) ，充分 膨胀凝胶。取出，冷却至室温后备用。 2 、装柱： 关闭下口，向玻璃柱内加入蒸馏水达柱总长度约 1/3 处，把膨胀好的糊状凝胶边搅拌、边自柱的顶端沿管内壁缓 缓加入柱中至柱顶部，待柱底部凝胶沉积至 1-2cm 时，开启 柱底部出水口，并控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在 溶液中。再慢慢地继续加入凝胶，直至凝胶体积至柱顶 2.5cm 左右，最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒 轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少 8cm 。 最后放入略小于层析柱内径的圆形小滤纸片，以防将来加样 时凝胶被冲起。 4. 操作步骤 3 、平衡： 用 10ml 左右的蒸馏水流洗整个柱床。操作过程中严 防出现气泡和分层，如床面不平，可用玻璃棒轻轻搅动表面， 是凝胶重新自然沉降。整个过程中勿使液面低于床面，以免 气体进入，使柱床干裂。 4 、加样： 待柱床面以下的蒸馏水流出，且刚好与床面相切时 ( 切不可使床面完全暴露于空气中 ) ，关闭下口。用滴管取血 红蛋白及鱼精蛋白混合液（血红蛋白稀释液 3 滴加 DNP- 鱼精 蛋白溶液 3 滴），十分小心地并缓缓沿内壁加入 ( 注意切勿破 坏柱床面 ) ，打开柱底部出口，使样品进入床内，至床面重 新露出时，先加入少量的蒸馏水，冲洗床面 1-2 次，然后再 加入足量蒸馏水。 4. 操作步骤 5 、洗脱和标定： 用试管收集洗脱液体。调节流速使液体均 匀流出（约 1ml/min ），同时记录如下数据：起始、红始、 红终、黄始、黄终、终止 (1.5 倍柱体积 ) 。观察血红蛋白 与鱼精蛋白的洗脱次序并记录实验现象 ( 注意洗脱过程中 随时添加蒸馏水，以免干柱 ) 。 6 、清洗： 待所有色带流出层析柱后，继续加入蒸馏水并加 快流速，清洗层析柱至凝胶洁净