实验大肠杆菌感受态细胞制备与转化.pptVIP

实验六 大肠杆菌感受态细胞 的制备和转 PCR 质粒DNA提 取和酶切 基 因工程的基本路线 连接 转化 Expression of target proteins 操作步骤 (一)受体菌的培养 1、-70%C或-20℃低温冰箱取出菌种后,在LB培养液中培养过夜,进 活化 2、取几微升活化后的菌液(取量视菌的密度而定)在LB平板上涂布,于 37℃培养箱中培养24h;从LB平板上挑取单菌落接种于3-5mLB液体 培养基中,37°C下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期 3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37°C振荡培 养2-3小时至OD600=0.5左右(生长对数期)。(注:这一步非常关键 培养过度的菌液含有较多的老细胞,制备成感受态细胞后其接受外援 DNA能力较低,从而导致转化率降低 )、感受态细胞的制备(CaCl2法) 1、将1.5m菌液移入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4°C下 5000rpm离心5分钟。 2、弃去上清(轻轻倾倒掉上清液,并用吸水纸或移液器移除残余 的过多水分)。 3、加入1m预冷的0.1mo/的CaCl2溶液,轻轻拨动管底使细胞 完全悬浮冰上放置15分钟后4℃C下5000rpm离心5分钟 3、弃去上清加入0.2m预冷的0.1mo/L的CaCl2溶液轻轻悬浮细 胞,即制成感受态细胞。将感受态细胞悬液分装成2份,每份